本周要给大伙介绍的是单细胞测序相关的文章，单细胞测序问题一直是生物发展领域的一个大问题，文章开始的图是单细胞测序的发展历程。2009年北京大学汤富酬教授在Nature Method上首次发表了单细胞痕量mRNA测序方案，该方案在2013年被Nature评为年度技术，但其测试通量较低，因此2015年两篇基于液滴的单细胞测序技术Drop-Seq发布在Cell上，其大大提高了单细胞测序的通量，并成为了最成功的商业化单细胞测序公司10Xgenomics的技术基础。两篇分别是
1.Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.
Cell 161(5):1187-1201.
2. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.Cell161,5 (2015): 1202-1214.
今天主要给大家介绍的是第二篇文章，主要来自于Harvard Medical School 的 Steven A. McCarroll 教授，McCarroll 团队主要工作是通过用人类遗传学，分子生物学和工程学来创造研究人类大脑的新方法，揭示基因组因人而异的方式，并发现导致脑部疾病的分子和细胞过程。McCarroll和他在哈佛大学的团队将精神分裂症与特定的基因变异联系起来，这些基因变异将免疫分子招募到大脑中的“修剪”突触中，这一发现正在引领思考精神分裂症生物学基础的新方法和发现药物的新方法。在领导他的实验室之前，McCarroll在加州大学旧金山分校获得了神经科学博士学位。他目前还担任布罗德研究所斯坦利精神病学研究中心的遗传学主任。 McCarroll实验室的实力自然不容置疑，他们承担了大量关于基因组测序的工作。
此外其液滴部分也就是我现在做的领域微流控技术，主要合著者是Harvard SEAS 的David A. Weitz 教授。David 是我们老板博后的导师，也算是我们微流控工程应用的开山人物了，我觉得他做的内容还是很多很有价值的。第一篇文章就主要是Weitz实验室的工作，他们开创性的创造了一种水凝胶珠子，这项工作更为巧妙，但水凝胶的结构相对来说没有磁性珠稳定，因此目前商业化程度较好的是第二篇文章用的测序方案。两篇文章用于生产液滴的微流控芯片建构如下图所示，这么成功的单细胞测序方案的关键部件其实就是这么小的一个不到100mm的芯片结构，不得让人赞叹。
英文摘要
Cells, the basic units of biological structure and function, vary broadly in type and state. Singlecell genomics can characterize cell identity and function, but limitations of ease and scale have prevented its broad application. Here we describe Drop-seq, a strategy for quickly profiling thousands of individual cells by separating them into nanoliter-sized aqueous droplets, associating a different barcode with each cell’s RNAs, and sequencing them all together. Drop-seq analyzes mRNA transcripts from thousands of individual cells simultaneously while remembering transcripts’ cell of origin. We analyzed transcriptomes from 44,808 mouse retinal cells and identified 39 transcriptionally distinct cell populations, creating a molecular atlas of gene expression for known retinal cell classes and novel candidate cell subtypes. Drop-seq will accelerate biological discovery by enabling routine transcriptional profiling at single-cell resolution.
正文内容
文章的主要过程就是下图所示和对应的步骤
1.准备材料：从组织中分离细胞，制备细胞悬浮液；制备带有分子条形码的微珠悬浮液。
2.制备微滴：将细胞悬浮液与微珠悬浮液泵至芯片，再与油相汇聚形成单分散的微滴，将每个细胞与一个微珠一同包裹于同一微滴中。
3.RNA杂交：裂解微滴中的细胞，细胞释放mRNA，与微珠上的分子条形码杂交。
4.逆转录：裂解微滴，释放mRNA杂交物，开始逆转录，以形成mRNA逆转录物（STAMPS）
5. PCR扩增：在核酸外切酶的作用下，将每条mRNA逆转录物“切下”，并以PCR方式进行核酸扩增，以放大基因信息。
6.测序分析：使用各种生物信息学工具进行测序分析。
这个图主要介绍的是Barcoded的组件，就是在纳米珠子表面再修饰上基因组，PCR handle用于后续把基因组从珠子上洗脱下来使用，而Cell barcode则是对每个细胞进行编码使用的，一个cell barcode对应一个微液滴对应一个单细胞，UMI主要是用于纠错使用，尾部用Oligo TTT(T27)的尾端结构主要是用来捕获mRNA使用的，其具有极高的Poly A(聚腺苷)结合能力，可以高效捕获mRNA。磁珠的主要合成过程就是如C和D所示，不断再表面快速修饰基因组，然后形成随机的珠子，一个珠子可以捕获单细胞大量mRNA，实现测序功能。
大概的效果如图所示。
