Nature：简易的声学动态气液界面三维打印技术
文摘
2024-11-25 15:28
浙江
本周要介绍的文章是来自于墨尔本大学生物工程系的David Collins教授课题组的工作。David是柯林斯生物微系统实验室负责人。他的研究方向是开发先进的生物打印系统，使用集成驱动的微流控系统来实现从单细胞环境到宏观尺度结构的尺度的跨越。增材制造是一项迅速扩展的多学科领域，其应用范围包括医疗器械、航空航天部件、微制造技术以及人造器官。在众多增材制造方法中，基于光的打印技术（例如双光子聚合、投影微立体光刻和体积打印）因其打印速度、分辨率或在生物制造中的潜在应用而备受关注。本文提出了一种新的三维打印方法——动态界面打印。该方法利用声学调制的受限气液边界，在短短数十秒内快速生成厘米级的三维结构。与传统的体积打印技术不同，这一过程无需复杂的反馈系统、特殊的化学设计或复杂的光学装置，同时保持了高效的打印速度。文章展示了这一技术在多种材料和复杂几何结构中的广泛适用性，包括那些使用传统逐层打印方法无法实现的结构。此外，文章还证明了其在原位快速制造复杂结构、重复打印、结构并行化及生物制造等方面的独特优势。更进一步地，作者们发现气液边界的表面波形成能够增强物质传输性能、改善材料灵活性，并实现三维颗粒图案化。因此，作者们预期这种方法在高分辨率、可扩展性产量以及生物相容性打印需求较高的应用场景中将具有重要价值。快速三维打印技术可在数秒到数分钟内完成整个部件的制造，而非传统的数小时，因此逐渐被视为生物打印、原型设计和制造领域中一项具有突破性意义的技术。传统的基于光学的打印方法，如立体光刻，通过逐层固化材料来构建目标结构。这类方法在分辨率和几何保真度方面具有优势，但由于需要在每一层打印完成后调整部件位置以便未固化树脂流动，这种工艺对打印速度、材料组成和生产效率形成了限制。近年来，体积打印技术被用于快速制造厘米级构造。比如，计算轴光刻技术通过旋转充满光聚合物的容器，并从不同方位角对其投射一系列等光心投影，利用累计光交叉点创建目标对象。这一过程依赖于局部氧气耗尽来限制聚合反应，因而对聚合剂剂量和材料组成的敏感性较高。尽管计算校正可以在一定程度上缓解这些影响，但其仍对系统中的树脂和生物墨水使用产生限制。其他新兴方法如交洛刻印和光片打印，采用双步骤光化学工艺，通过两种波长光源（光片和正交投影）同时引发聚合以构建目标对象。尽管这些体积打印技术能够快速生成漂浮的各向同性结构，但受限于对特殊光学系统或材料配方的依赖，尤其是在体积分辨率与材料透明度密切相关的情况下，这些技术对添加剂（如细胞、颗粒材料和染料）的使用形成了约束。此外，在传统底部上升式立体光刻中，氧气可以作为自由基猝灭剂，用于在打印界面抑制聚合反应。例如，连续液体界面生产技术使用氧气透过膜作为制造界面，在此处形成聚合“死亡区域”，从而实现材料的连续补充。然而，该技术需从浅层液体池中逐渐抽取已打印结构，对于水凝胶等软材料可能会出现结构不稳定的问题。在本研究中，我们提出了一种基于声驱动受限气液界面的快速三维打印技术，该方法能够在气液界面快速生成任意无支撑结构，无需特殊化学工艺或光学反馈系统。此方法兼容多种材料，包括柔软且具生物相关性的水凝胶，具有适合高活性组织工程、可扩展制造及快速原型制作的速度优势。动态界面打印(Dynamic Interface Printing, DIP)
动态界面打印（DIP）利用一个底部开口且顶部由透明玻璃窗密封的中空打印头。将打印头浸入液态预聚合物溶液中会在其内部形成一个空气囊，其底端形成气液界面（液膜）。该界面作为打印区域，通过从上方透过玻璃窗的可见光（波长λ = 405 nm）进行聚合反应（见图1a及补充图1）。光投影系统将图案化的横截面投射至界面上，与液膜的形状相一致，投影的平面分辨率为15.1 µm，照射强度范围可调（0–270 mW cm⁻²）。通过调节打印头内的气压，可以精确控制气液界面的高度和曲率，使其与光投影焦平面保持共面。一旦完成对准，代表目标三维结构区域的二维图像将按照序列通过打印头沿轴向投射至界面上。随着打印头相对于打印容器逐步升高，整个对象在几秒内被连续构建完成。DIP 独特的优势在于其能够动态调节打印头内的气压，从而控制打印过程中气液界面的形状和位置。这种调节可以保持固定状态，生成静态液膜；也可以通过调整振幅和频率的声学调制，形成毛细重力波（图1b）。气液界面的具体位置由打印头的垂直位置、打印头内的静态气压以及声学调制的振幅与频率的叠加共同决定。这种振荡驱动可以连续激活（图1c，右上），也可以在投影之间短暂激活（图1c，右下）。由于光学系统与声学调制均集中在打印头内，DIP 不依赖特定的打印容器形状或光学属性，与其他高通量打印方法相比，其具有容器无关性。通过利用气液界面的毛细重力波驱动质量传递，DIP 能够以高分辨率快速生成复杂结构（图1d, e 和补充视频1）。本文展示了如何利用这种模式提升打印速率、扩展材料加工范围，以及实现三维颗粒模式化和多次打印叠加功能。这种方法可以在数十秒内快速制造多种厘米级对象。凸面切片技术
与其他基于光的打印技术类似，DIP 首先需要将目标几何结构的三维数字模型转化为一系列图像，逐步投影至打印界面。然而，与传统平面打印界面不同，DIP 的打印界面是一个弯曲的气液界面，这需要一系列适应界面曲线的图像，来准确表示目标物体的三维区域。打印过程从将液膜界面压缩至打印容器底部开始，形成一层薄液膜，其最大尺寸由打印对象的尺寸决定。随着打印进行，压缩的界面逐渐收缩，直到其中心切线与容器底部相切。在这一短暂的过渡区域后，界面的形状可以通过杨-拉普拉斯方程计算。为了预测界面在初始压缩和过渡阶段的形状，首先利用贝塞尔曲线计算杨-拉普拉斯方程的稳态解，得到未压缩界面的近似形状。中间的压缩区域则通过在单轴变形下保持体积不变的假设进行近似计算（图2a 和补充图4a）。通过使用圆柱形打印头，可以将凸界面的三维形状通过围绕打印头中心轴旋转二维贝塞尔解生成（补充图4b,c）。投影序列是通过用三维贝塞尔曲面逐步切割输入几何的笛卡尔体素阵列计算得到的（图2b）。这种切片方案确保了投影到弯曲界面的二维图像能够在每个中间位置正确再现三维目标物体（图2c 和补充图5）。DIP 的特性与生物打印的优势
除高通量制造外，DIP 在生物打印中的应用尤为突出，其高打印速度和相较于其他光基或挤出式打印技术在气液界面处产生的剪切力更小。这一特性使其特别适用于制造生物模型。DIP 可用于硬丙烯酸酯（如1,6-己二醇二丙烯酸酯，HDDA）以及生物相关材料（如聚乙二醇二丙烯酸酯，PEGDA 和甲基丙烯酰基明胶，GelMA）的打印。为了表征其跨多种材料类型的打印能力，我们研究了光功率对打印速度的影响（图 2d）。尽管树脂的最大打印速度受光引发剂浓度、单体官能化程度、材料粘度和光功率的影响，但我们在此选用常见配方以便对比。例如，我们使用光引发剂锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸盐（LAP，浓度最高为 0.3%），其生物相容性已被证实。在270 mW cm⁻² 的光剂量下，PEGDA 水凝胶实现了超过700 µm s⁻¹ 的线性打印速度。即便使用更低光功率（30–50 mW cm⁻²），仍可在短短数十秒内打印出厘米级构造，这更适合生物打印应用。由于打印界面本质上是曲面的，将平面投影映射至界面会导致图像在打印头边界处失焦。失焦程度主要取决于影响毛细长度的材料特性及材料与打印头之间的接触角。如果需要均匀的投影分辨率，则可通过理论约束评估液膜界面的可用部分。根据高斯光束理论的分析（补充图6），可以预测焦平面上方z 位置的等效失焦像素尺寸（点扩散函数）。结合特定材料配方的贝塞尔界面轮廓解，可确定维持高分辨率的界面区域分数（图2e）。对于同一材料，较小的打印头因毛细长度与打印头直径的比值较大而导致像素面积分数较低。相反，较大的打印头中毛细长度占直径的比例降低，界面趋向于自由表面。类似地，表面张力较低或密度较高的材料因毛细长度较短而拥有较高的像素面积分数。声学调制
DIP 的核心特性之一是其气液边界可通过声学调制产生振动。这些振动既可用于改进光基打印过程，也可为三维打印构造引入额外的图案化自由度。气液界面的模式取决于打印头形状、振动频率、振幅及界面相对于底层结构的位置。通过声学调制生成毛细重力波，可在界面下方流体中产生流动（图 3b），从而增强材料输运能力，提高打印速度和精度。为激发界面波动，我们采用了一种新方法，通过调节液膜上方打印头内的封闭空间（图3a 和补充图1c,d）。此方法不仅保留了 DIP 容器无关的优势，还大幅减少了压力场与材料容器形状之间的耦合。此外，打印界面处生成的毛细重力波衰减迅速，使得在单次打印过程中可高度控制并组合不同的声学信号（补充图7, 22 和 25）。为了展示打印界面上可能出现的波动模式，我们在打印头内部安装了一圈多色LED，用以反映界面在频率增加时的表面变化（图3c）。在低频下，形成了具有递增方位角数的单色模式；而在高频下，则产生了具有N次旋转对称性的波。这些波模式在气液界面处同时引发切向与法向的流体流动。通过粒子图像测速（PIV）和计算流体动力学（CFD）模拟（补充图8–11、20、21和23–25，以及补充视频2和3），量化了流体输运性能。在低振幅激励下，静止的打印头可在界面及体液中生成超过10 mm/s的流速（图3d,e）。与水平界面上的流动相比，曲面界面促进了次级流效应，从而进一步增强了物质传输（补充图10和25）。在打印过程中，将界面激励与打印头平移相结合，平均流体速度可达17 mm/s至45 mm/s（图3f）。这一趋势在较高粘度下依然成立，表明界面激励显著增强了材料流入能力，且与粘度无关（补充图11和12）。基于这一输运规律，我们的分层切片软件能够预测并调整打印速度，优化流体路径长度，某些情况下可将总打印时间再减少约60%（补充图13）。除了提高过程吞吐量，声学调制还可减轻含颗粒添加剂结构（如细胞）在打印时的异质性问题。颗粒常在打印中沉降，体积打印技术通常依赖高粘度预聚物溶液或热凝胶（如GelMA）来最小化沉降。然而，对于热凝胶材料，打印容器及悬浮细胞需在使用前冷却，尽管打印时间较短，但整个流程（冷却、打印、复温及去除未聚合材料）耗时与传统数字光投影（DLP）过程相当。在本研究中，我们通过声学调制主动混合打印液体以缓解沉降问题（图3g和补充图15）。此外，声学作用可在打印期间促进悬浮物进一步集中至界面以下，使得包裹效率提高约两倍，优于未使用声学调制的打印结构。这一改进结合结构各向同性的增强，降低了创建致密支架所需的颗粒添加剂或细胞总量。DIP 的功能扩展
传统自上而下立体光刻依赖于无约束的气液界面，受限于物质传输与材料膜的均匀性，从而限制了吞吐量。虽然缩短流体路径长度可以部分缓解此问题（补充图13、23和24），但会对可打印几何结构施加显著限制。为进一步探讨 DIP 的动态特性，我们通过模拟与其他已建立的气液模式对比其打印行为（补充图22–24）。在直径为15 mm 的打印头中，通过增大结构直径（DS =
4–14 mm），DIP 的流速相比于传统自上而下立体光刻提高了约4倍（补充图25）。结合声学调制后，流速进一步提高约10倍。为实际验证界面调制对物质传输的提升，我们打印了一系列厚流体歧管，其中包含多个独立的流体路径（图4a–c 和补充图28）。随后，为研究界面曲率对像素区域分数的影响，我们使用直径10 mm 的小型打印头在HDDA中制造了一系列微格子结构和柱阵列。若未采用凸面切片技术，打印边缘的失焦及曲面平面失配导致结构边缘变形且附着力不足（图4d）。相反，通过应用凸面切片并匹配视场至预测的有效区域分数，成功创建了特征尺寸约30–100 µm的均匀柱阵列（图4e）。图4: 动态界面打印应用展示
DIP技术进一步拓展了部分遮挡或完全不透明材料结构的制造能力。例如，高含量细胞的水凝胶因其组分折射率不匹配通常呈现不透明状态。在体积打印中，光需要不受阻碍地穿过打印体积，因此基底材料与细胞材料之间的折射率匹配至关重要。虽然这一问题可通过计算方法部分克服，但在DIP技术中，光传输仅限于气液界面的薄层区域，最小化了悬浮材料的散射与吸光效应。为验证此特性，我们设计了一种去氢枯基功能化的海藻酸钠，通过调节pH值增加不透明度，直至完全遮挡美国空军测试靶标（图4f）。即使在完全不透明的情况下，仍可在33秒内制造高度为10 mm的三尖瓣水凝胶结构，该结构的内部瓣膜厚度为300 µm，经微型计算机断层扫描成像确认（图4g）。通过设计打印头几何形状，可以进一步控制、调制和分布多个打印界面。例如，我们开发了一个3×3的独立界面阵列打印头，并用其并行打印出“DIP”字母（图4h和补充视频5）。通过优化打印头的孔径设计及排列，可进一步调节受约束表面的有效振幅和频率，从而影响流动特性。通过在气液界面形成驻波，可以实现对悬浮材料的空间图案化。当暂停打印过程、将界面缩回打印头并施加声学激励时，可在结构顶层表面形成水动力势场。势场会使颗粒从高势能区域迁移至低势能区域，最终在驻波的节线上聚集（补充图26），具体分布依赖于驻波的频率及节线位置。尽管机械和水动力的节线图案化已有实现，但这些方法通常局限于二维或固定节线位置。通过结合声学图案化与基于光的打印，我们展示了基于频率和振幅组合的模块化3D颗粒排列（图4i）。图案复杂度还可通过调整打印头的横截面形状进一步提升。未来可通过优化边界形状生成目标声场，但需进一步研究界面与结构拓扑的复杂水动力交互。此外，DIP技术的气液界面允许固体部件穿越打印界面，从而实现多材料或多部件结构的原位打印。例如，我们制造了一个球窝关节（图4j），先打印了窝壳，然后插入直径为10 mm的球体，最后打印了球窝盖及杆体，将其固定在球体上。为验证DIP对软材料的独特优势（补充图14和27），我们评估了其作为生物制造工具的潜力。由于光仅需穿过气液界面到达光敏聚合物，与其他自由表面方法类似，其光学特性和容器形状的约束性较低，而其他方法需要光部分或完全穿过打印体积。然而，DIP的结构高度受限于总容器体积与打印头排除体积的比值，以避免材料溢出。未来可通过流体路径逐步注入材料来缓解这一限制。同时，打印头可在三维空间自由移动，便于顺序制造（补充图16a）。DIP还支持将不同密度的材料作为制造平台（补充图17），不仅可以在同一容器中打印多个结构，还可顺序原位打印多个容器中的结构（例如多孔板；补充视频4），这些容器可包含不同的细胞类型、材料或几何形状。为初步评估该技术在生成载细胞、具有生物学相关性的构建体中的可行性，我们直接在12孔板中打印了简化的肾形水凝胶结构，使用密度为7.2 × 10^6 cells/mL的HEK
293-F细胞（图4k）。经过24小时荧光显微成像，显示出低工艺细胞毒性和高细胞活性（约93%，图4l和补充图18）。总结与未来展望
DIP实现了约10^4 mm³/min的体积制造速率，超越了包括计算轴向光刻和xolography10在内的其他高速打印工艺，无需特殊光化学或光学反馈机制。这得益于表面张力驱动的打印，并进一步通过声学驱动的界面流动提升效率。通过增加打印头界面数量，可实现多孔板内同步制造，进一步提高吞吐量。DIP的可渗透打印界面提供了可控的打印过程调节能力，包括原位叠加打印、质量传输调控及3D图案化。未来的DIP应用可能包括将声学驱动的输运系统直接集成至打印头，或从内部实现多材料的顺序切换。进一步研究可探讨更复杂的声学图案化策略，通过模拟优化结构或打印头边界形状来生成目标声场。此外，采用更高数值孔径可实现快速微尺度制造，而无需双光子系统的高成本。我们相信，DIP因其快速打印高分辨率构建体的能力，特别是在软材料及生物相关材料中的表现，将对生物制造产生重大推动力。DIP技术的界面定位能力及原位制造潜力，突显了其未来在高通量生物制造中的应用前景。方法
版本 1：DIP系统的组件安装在两个正交的光学实验板上，以确保垂直和水平组件的精确对齐（详见补充信息第1节和补充图2a）。截面图像通过高功率投影模块（LRS-WQ，Visitech）捕获，分辨率为2560×1600像素，像素大小为15.1 μm。投影模块和打印头通过一个安装在垂直实验板上的100 mm线性滑台（MOX-02-100，Optics Focus）沿z轴方向定位。气液界面的高度通过一个与打印头相连的50 ml注射器和硅胶管控制，该系统由一个50 mm线性滑台（MOX-02-50，Optics Focus）加压调节。此外，两个线性滑台（MOX-02-100，Optics Focus）使比色皿或多孔板能够精确定位，用于顺序或多步骤打印。运动控制使用一个商用3D打印机控制板（BIGTREETECH，SKR 3）及其定制DB9接口板完成。打印过程的正交视频通过一台配备16 mm镜头的4K CCD相机（AmScope，HD408）记录。版本 2：第二代系统用于原位成像，修改后打印容器能够相对于固定探针移动（详见补充图3）。该系统集成了定制的CoreXY运动系统及NEMA 23滚珠丝杠线性滑台，以使整个CoreXY系统相对于固定打印头移动。原位成像通过蓝色反射二向色镜（35-519，Edmund Optics）和50:50分束器实现照明（43-359，Edmund Optics）。照明可以通过同轴方式提供，也可以通过一个定制的带红色准直背光的孔板支架提供。为了在打印过程中保持生理温度和无菌环境，运动组件和打印头被封装在定制的加热腔中。无菌环境通过打印期间持续的HEPA过滤、70%乙醇表面消毒及使用前的紫外线C消毒实现。打印头
在本研究中，打印头的尺寸根据所需树脂容器的大小调整。大多数配置中，我们使用轴对称圆柱形打印头以简化界面形状的计算，尽管其他（任意形状）打印头边界轮廓也同样可行并已被证明。在更复杂的打印头拓扑下导致复杂界面形状时，可以使用例如Surface Evolver或SE-FIT等数值方法。本研究中打印头的尺寸范围为30至5 mm。物体在x和y方向上的尺寸受到投影仪焦平面总视场的限制，物体高度则由打印头的长度限制，该长度与投影焦距和容器体积与打印头置换体积的比值内在耦合。在本设置中，打印头的总可浸没长度约为70 mm。值得注意的是，通过将投影和照明光学元件浸入或增加投影系统的工作距离，可以实现概念上更高的结构。打印头通过商用3D打印系统（Form 3+，Formlabs）制造，具有SM2螺纹插入件，可在系统版本2中快速更换打印头。玻璃窗通过垫圈和打印头顶部夹紧，以保持气密的封闭体积，同时允许光线沿中心传输（详见补充图1a,b）。打印头还包括一个内部通道，可以通过注射器系统和声学调制装置将气体输送到打印头腔体内。此接口用于在打印过程中保持或调节气液界面的形状。声学调制装置
气液界面的声学调制通过直接操控打印头内空气体积实现。原理非常简单：装置包括一个3英寸15 W的音圈驱动器（Techbrands, AS3034），固定在一个带有入口和出口端口的封闭3D打印歧管上（见图3a，补充信息第2节和补充图1c,d）。音圈通过商用放大器（Adafruit, MAX9744）驱动，波形通过MATLAB GUI发送。频率范围为1到500 Hz，支持固定频率或瞬态频率与振幅切换。通过为每个自由度指定波形，可以轻松将声学调制与运动、光学和压力控制同步（见图1c）。
