Nature Chemistry: 化学燃料驱动的DNA凝聚体配对与解离
文摘
2024-11-11 12:41
浙江
Template-based copying in chemically fuelled dynamic
combinatorial libraries本周要介绍的文章来自于慕尼黑工业大学Job Boekhoven 课题组，Boekhoven课题组的主要工作集中于在合成化学、生物物理学和生物化学之间的界面上工作，受生物学化学的启发，合成像生物学一样复杂、复杂和美丽的分子结构。
科学面临的最大挑战之一是理解生命如何能够从分子混合物中自发地出现。复杂的一点在于，生命及其分子本质上是不稳定的——RNA和蛋白质易于水解和变性。对于生命的从头合成或更好地理解其起源，需要选择机制来保护这些不稳定的分子。在此，我们提出了一种以化学燃料驱动的动态组合库，以模拟RNA的寡聚化和去寡聚化，并揭示在动力学控制下的选择与纯化机制。在实验中，寡聚体只能通过连续的生成来维持。杂交是一种强大的工具，可用于选择不稳定的分子，提供寡聚化和去寡聚化速率的反馈。此外，我们发现模板作用可以用于纯化寡聚体库。此外，在基于凝聚态的原始细胞中，模板辅助的寡聚体形成会改变其隔间的物理特性，例如它们的融合能力。这种寡聚体生产与物理特性的相互耦合是迈向合成生命的重要一步。在动态组合库中，分子可以可逆地反应，形成一个相互转化的库成员混合物。这种过程中产生的产物具有统计分布，通常会偏向于生成热力学上最稳定的产物。自组装和杂交进一步提高了产物的热力学稳定性，从而增加了选择的可能性。这些相互转化的分子混合物为研究生命分子从原始分子混合物中被选择的机制提供了有吸引力的途径。动态组合库还显示出能够引导自我复制分子的达尔文式进化，因为系统向平衡状态演变。然而，生命无法在平衡状态下存在。生命通过不断转化能量逃离平衡，并利用该能量传播信息和结构。因此，适用于动力学控制下的选择规则和机制更具生命意义，这些机制可能不同于热力学控制下的机制。Fig 1. Template-based copying controls
selection in chemically fuelled libraries, and when this happens inside a
coacervate it alters the coacervate’s physical properties.在这项研究中，我们在化学燃料驱动的动态组合库中引入了模板作用，以研究模板如何影响动态组合库中的动力学选择。与传统动态组合库不同，化学燃料驱动的动态组合库处于非平衡状态，其中化学键的形成依赖于高能分子（我们称之为燃料）的消耗。新形成的键会通过水解自发地回到原来的状态，因此热力学稳定状态是初始分子池，而动力学选择机制则决定了哪些产物更受偏好。这与RNA或DNA的寡聚化过程类似，寡聚化是一个能量上升的过程，而通过水解的去寡聚化则是自发的。我们发现杂交是动力学选择的有效工具：杂交可以保护寡聚体免受水解并促进其寡聚化。我们将这些机制——保护寡聚体免受水解和促进其寡聚化——分别称为模板对寡聚体的负反馈和正反馈。这些反馈机制可以选择特定长度和序列的分子。此外，我们展示了该库能够改变其环境的物理特性。因此，具有模板的隔间影响了库的组成，而库反过来也影响了隔间。这种表型与基因型之间的相互耦合使我们更接近在未来的研究中探索系统中的达尔文式进化。Fig. 2: Description of the chemically
fuelled library.我们使用对苯二甲酸作为单体，它可以在冷凝剂EDC的作用下进行寡聚化。这些寡聚酸酐通过水解自发地去寡聚化。我们将核苷酸碱基胸腺嘧啶连接到对苯二甲酸上，形成胸腺嘧啶标记的单体T（图2a）。单体T可以二聚成DynT2，后者可以进一步反应形成其他寡聚物（DynTn；图2b和扩展数据图1）。此外，当寡聚体相互反应时，也可以发生由燃料驱动的寡聚化。我们在寡聚酸酐的骨架中设计了六个原子的重复单元，键长为7.14 Å，这样它与RNA或DNA重复单元骨架的六个原子长度（键长为7.65 Å）相匹配（图2a，补充表1和补充说明）。我们的单体T与（dA）10 DNA模板的结合解离常数KD为91.9 ± 12.7 mM/结合位点，通过NMR滴定法测定，比我们为脱氧胸腺嘧啶单磷酸盐（dTMP）测得的KD值低约三倍（扩展数据图2a，b）。这可能是因为T在模板的对苯二甲酸骨架和腺苷单元的堆叠作用下，结合力较强。我们将25 mM的T溶解在200 mM MES缓冲水中，pH 6，加入10 mM吡啶，并添加10 mM EDC。在有无DNA模板的情况下，我们通过HPLC和质谱分析了库的组成演化，DNA模板由十个腺苷单元组成（（dA）10；图2a和补充表2–4）。没有模板时，我们发现燃料在30分钟后完全消耗（补充图1b），导致了瞬态的寡聚物DynT2–DynT5（图3a和补充表3）。值得注意的是，即使使用更高的燃料浓度或较低的吡啶浓度，我们也没有观察到大于五聚体的寡聚物。主要成分是酸酐DynT2。相比之下，DynT3的最大浓度大约低了19倍，为0.05 mM。DynT4和DynT5的最大浓度则更低，分别为0.006 mM和0.004 mM（图3b–d和补充图1a）。最大浓度随着寡聚体长度的增加而递减，原因有二。首先，一个反应的产物是下一个反应的前体；例如，DynT2是向DynT3的寡聚化所必需的。其次，高级寡聚物的水解生成较短的寡聚物。一旦所有燃料被消耗，所有的寡聚物都会衰减，即库只能在非平衡状态下存在，并消耗化学能量（图3b–d和补充图1a，b）。经过一轮反应后，我们发现了一些不需要的副产物N-酰基异脲（T*），但其浓度保持在0.5 mM以下（补充图1c和补充表4）。Fig. 3: The template controls the kinetics
of the chemically fuelled dynamic combinatorial library.我们设计了一个动力学模型来描述燃料响应下所有反应物的时间依赖浓度（见方法和扩展数据图1）。该模型考虑了由燃料驱动的激活过程和寡聚物的自发水解。通过最小二乘拟合速率常数，动力学模型很好地预测了燃料和寡聚物的实验数据演变。值得注意的是，我们观察到寡聚化和去寡聚化依赖于寡聚物的长度（图3b–d，补充图1a,e–o和补充表5）。我们测试了在模板存在下，化学燃料库的反应。在（dA）10模板的作用下，DynT2仍然是反应初期的主要寡聚物（图3a）。然而，当所有燃料消耗完后，较长寡聚物的最大浓度（例如DynT3、DynT4和DynT5）分别比没有模板时高出五倍、十三倍和七倍（图3b–d和补充图1b）。此外，我们发现DynT2–DynT5的存在时间比没有模板的实验多了1到2小时。从这些观察中，我们推测模板强烈地影响寡聚化和去寡聚化（分别见图3f,g）。我们假设模板对寡聚化的反馈机制涉及寡聚物在模板上的预组织，类似于DNA或RNA的模板介导连接。我们还假设模板可以保护寡聚物免受去寡聚化的影响（见下文）。有趣的是，类似的模板保护机制已在RNA中报告过，即双链RNA比单链RNA更稳定，并且此前被探索作为促进序列复制的机制。质谱法显示了由（dA）10与单体T和寡聚物DynT2–DynT5形成的复合物的证据（补充表6）。此外，天然凝胶电泳显示，在DynT寡聚物存在下，模板条带呈现出宽化并向较高分子量偏移（图3h和补充表7）。对于纯（dA）35和缺乏（dT）10的混合物，我们观察到一个较弱但缓慢迁移的条带，这最可能来自（dA）35在较低pH、高盐和高DNA浓度下的自我聚集。值得注意的是，在变性条件下，寡聚物/模板复合物的条带并未发生迁移，证实了我们的观察来自于杂交作用（扩展数据图3a）。我们将动力学模型扩展到包括模板作用，添加了可以在模板上发生的反应。该模型预测了溶液和模板上每个库成员的浓度，使用了库成员与模板之间的解离常数KD值（见补充说明，图3b–d和补充图1a–d）。对于单体，我们使用了实验测得的解离常数。我们假设随着寡聚物长度的增加，结合常数减小，这与文献中的研究一致（补充表8）。我们在溶液和模板上的寡聚化和去寡聚化速率常数与之前使用的一致。然而，动力学模型低估了寡聚物的浓度和寿命。只有假设模板上没有去寡聚化反应，实验数据才能很好地预测（图3b–d和补充图1a–d及图2）。这一初步观察表明，杂交作用可以保护免受水解，这与我们实验中的观察一致，即有模板时，寡聚物存活的时间更长（图3g）。此外，模型预测溶液中的库成员消耗了90.3%的EDC，而模板上的库成员仅消耗了9.7%的EDC（补充图3）。鉴于溶液中单体浓度较高，这90.3%的燃料大部分用于形成DynT2。具体而言，在模板存在下，溶液中的平均寡聚物长度为1.02，这与我们观察到的单体在库中的主导地位一致（图3e和扩展数据图4a）。相比之下，模板上的平均寡聚物长度为1.78，来自于大量的二聚体、三聚体和四聚体（图3e和扩展数据图4b）。换句话说，寡聚物在模板上积累，因为它们的解离常数比单体低31。因此，模板上发生的寡聚体之间的连接频率较高（图3f，模板上）。因此，尽管模板上的库成员消耗的EDC远低于溶液中的库成员，但每次连接反应产生的寡聚物平均长度要比在溶液中长。我们引入了选择因子（S）来量化模板驱动的寡聚物生产。例如，S31是指在添加燃料31分钟后，通过HPLC测定的有模板与无模板情况下寡聚物浓度的比值。对于低模板浓度（即2 mM的（dA）10，按单体单位计算），DynT4的S31值大约为28，而DynT2为5左右。换句话说，模板的存在使DynT4的浓度增加了28倍以上。值得注意的是，S20和S38显示出相同的趋势，意味着选择趋势在时间窗口内是可推广的（扩展数据图3b）。实验中使用了25
mM的T，因此模板与库成员的比值为0.08。将模板浓度提高到8 mM（dA）10，DynT2–DynT4的S31值增加，但DynT5未见增加（图3i和扩展数据图3c）。DynT5的下降并不完全令人惊讶，因为第五个碱基对开始转动，形成B型DNA螺旋，每10.5个碱基对转动一次。似乎较长的寡聚物无法适应DNA的螺旋角度，从而偏向较短的寡聚物。令人惊讶的是，当我们进一步提高模板浓度时，例如提高到25 mM（dA）10，DynT3–DynT5的S31值急剧下降，而DynT2的值未变——更多的模板导致了较短的寡聚物（图3i和扩展数据图5）。积极的反馈机制可以解释这些最初看似反直觉的观察。实验是在亚化学计量的燃料下进行的，即对于每个单体，只有0.4当量的燃料可用。燃料的使用方式会影响寡聚物长度分布，例如，一个燃料分子可以与单体连接形成二聚体，或者两个二聚体可以形成四聚体。模板的存在影响了燃料使用的“效率”。在没有模板的情况下，两个寡聚物反应形成较长寡聚物的机会较小，因为寡聚物的浓度较低。在低模板浓度下，库成员之间争夺结合位点。这种竞争有利于较长的寡聚物绑定，因为它们的结合常数较高。因此，模板上的平均寡聚物长度较高，这有利于寡聚物的聚合。在较高的模板浓度下，提供了更多的结合位点，给单体提供了更多空间。有效地说，更多的模板稀释了模板上的寡聚物。这减少了两个寡聚物聚合的机会。换句话说，过多的模板会减少较长寡聚物的选择性聚合。如果上述机制成立，我们预期增加单体结合常数应该削弱模板对长寡聚物生产的积极反馈。因此，我们加入了已知可以降低DNA中解离常数的盐MgCl2。与我们的预期一致，MgCl2浓度的增加使DynT5的S31值逐渐下降，而在这些条件下，更多的DynT2被形成（图3j和扩展数据图3d）。请注意，我们在没有模板的控制实验中，使用和不使用MgCl2时，MgCl2并不影响DynT2–DynT5寡聚物的浓度。各个动力学曲线见扩展数据图5。基于上述机制，我们预期模板长度将影响动态库的长度分布。为了验证这一点，我们测试了不同长度的DNA模板，即（dA）4、（dA）7、（dA）35和基于RNA的多腺苷酸（pA；图3k和扩展数据图6）。我们通过监测S31分析了寡聚物组成的变化。有趣的是，使用（dA）4模板时，DynT5几乎完全被抑制，而DynT4仍然形成。这似乎表明模板长度控制了得到的最大寡聚物长度（图3k和扩展数据图6a–d）。当模板长度增加到（dA）7、（dA）10和（dA）35时，或切换为多腺苷酸RNA，不仅恢复了DynT5的形成，还增加了所有寡聚物DynT2–DynT5的浓度，因此它们的选择因子值增加了3到5倍（DynT2）和16到35倍（DynT3–DynT5）（图3k和扩展数据图6）。值得注意的是，加入多腺苷酸RNA选择性地增加了DynT5的浓度，分别增加了44倍和128倍。错配碱基对，例如G•T、G•U或A•C碱配对，可能会导致复制链中出现核苷酸突变。我们测试了我们的合成系统是否存在“错配”结构，通过测试T单体在非匹配模板（（dT）10、（dC）10和（dG）10识别基序）的寡聚化。我们发现选择因子的变化很小，表明错配碱基配对在DynTn的情况下不会起很大作用（图3l和扩展数据图7）。接下来，我们关注除了T以外的其他单体。我们在（dA）10和（dG）10模板存在下，利用U（尿嘧啶）或C（胞嘧啶）异苯二甲酸单体为库进行燃料反应。值得注意的是，当与异苯二甲酸结合时，嘌呤碱基（G和A）溶解性差，因此未能使用。利用U燃料，出现了多样的寡聚物库，包含DynU2–DynU5寡聚物（扩展数据图3e和补充表9、10）。在“正确”模板（dA）10的作用下，DynU2–DynU5的寡聚物产量和寿命增加。相反，“不正确”模板（dG）10仅稍微增加了DynU3–DynU5的产量和寿命（图4a–c和补充图4a–l）。当使用C时，产生了多样的寡聚物库，包含DynC2、DynC3和DynC4（图4a–c、扩展数据图3f和补充表11、12）。同样，使用“正确”模板（dG）10，寡聚物的产量增加。然而，C库受错配碱基配对的影响较大，因为（dA）10的存在也增加了寡聚物的产量（图4a–c和补充图4m–v）。Fig. 4: Selecting pairing nucleobases from
non-pairing nucleobases.从非配对的核苷酸中选择配对的核苷酸
为了探索混合库成员的选择性聚合，我们测试了是否可以从C单体中选择T单体（图4d）。我们将T和C分别以12.5 mM的浓度溶解在与之前相似的缓冲液中，并添加了10 mM的EDC作为燃料。在没有模板的情况下，我们观察到八种寡聚物：三种二聚体（DynT2、DynC2和DynTC）、三种三聚体（DynC3、DynT3和DynT2C）以及两种四聚体（DynT4和DynC4）（图4e，补充表3、4和11–13）。在反应初期，DynT2、DynC2和DynTC是主要的寡聚物，其中混合二聚体DynTC的产率最高。这一结果并不令人意外，因为DynTC可以通过两种途径形成。在2 mM（按单体浓度计算）的模板(dG)10存在下，库的组成保持不变，除了DynC3和DynC4，其浓度分别增加了4倍到20倍（图4e,f和扩展数据图8a–j）。有趣的是，在模板(dA)10的存在下，所有的寡聚物浓度均有所增加。特别是DynT2C、DynT4和DynT5的浓度显著增加。由于没有模板时未观察到DynT5，其S31值如果假设浓度低于液相色谱-质谱（LC-MS）检测限，将大于30。值得注意的是，DynC2和DynC5的浓度在模板(dA)10的作用下分别增加了大约5倍和20倍（图4e,g和扩展数据图8m–x）。我们推测，选择性受A•C错配的影响，尤其是在A•C配对时，这一点我们之前已经展示过。图4h,i中的序列标志图描述了在模板(dG)10和(dA)10存在下，寡聚物组（包括二聚体、三聚体、四聚体和五聚体）中T和C单体的相对频率。在模板存在的情况下，二聚体大约包含55%的T和45%的C。在模板(dG)10的作用下，三聚体和四聚体中T的比例较低（分别为5%），而在模板(dA)10下，四聚体（28%）和五聚体（0%）中的C的比例较低。综合来看，杂交性单体的选择性聚合及其在模板上的保护增强了T或C单体在正确模板中的长链寡聚物中的加入。然而，C的选择性受A•C错配的影响较大。从混合物中纯化核苷酸
我们还想知道，某些寡聚物的选择性结合是否可以用来纯化单体库。我们的假设是，通过模板驱动的寡聚物化-去寡聚物化循环，混合的单体经过不同的结合亲和力后，模板-寡聚物复合物随后的相分离能使单体库变得更纯。这个机制也可能为前生命环境下的纯化机制提供新的视角——因为前生命阶段的核苷酸合成很可能并未得到纯净的A、C、T和U，模板辅助的连接和选择性沉淀等纯化机制可能在其中发挥了重要作用。作为选择机制，我们使用了pA（RNA）与阳离子肽Ac-F(RG)3N-NH2（在pH 6下，浓度为5 mM）形成复合相的能力（图5a和扩展数据图9a,b）。我们通过混合0.86 mM（按单体浓度计算）浓度的pA和该肽，施加50 mM燃料，离心反应溶液，去除上清液并重新悬浮沉淀，然后通过超声处理悬浮液并重新启动循环。整个循环总共进行三次（图5b）。每次循环后，我们通过HPLC分析重新悬浮沉淀的组成（图5c）。第一次循环后，液滴由55%的T和45%的Me（即没有核苷酸识别基团的单体）组成。第二次循环后，库中几乎完全是T。第三次循环未进一步改变组成。我们推测第一次循环的效率低是因为两种单体在液滴中非选择性地分配（T和Me的log P分别为1.51±0.15和0.99±0.15）。因此，在第一次循环后，离心后的液滴没有进行选择。第二次循环中，由于大部分单体已经在第一次循环中被洗去，导致单体浓度较低，从而导致更具选择性的、模板驱动的吸附。Fig. 5: Extracting
T from a mixed monomer pool.进一步尝试纯化嘧啶类核苷酸（T和C）
接下来，我们尝试了在嘧啶类核苷酸（图5d中的T和C）之间进行纯化。两种单体的分配系数相似，分别为1.51 ± 0.15和1.33 ± 0.16。在第一次循环后，T和C在共沉淀相中的比例相等。第二次循环后，共沉淀相约含有60%的T和40%的C（图5d）。换句话说，选择性并不是特别高，可能是由于A•C错配的影响。接着，我们进一步扩展了单体库，加入了六种单体，即T、C、Me、甲基化T（Me-T）、甲基化C（Me-C）以及一种非天然的3-吡啶基邻苯二甲酸（3-pyridyl
IPA，图5e）。该库的组成为：T和C各占25%，Me、Me-T、Me-C和3-pyridyl
IPA各占12.5%。我们使用了以模板(dA)17(dG)13（即按单体浓度计算为0.34 mM腺苷和0.26 mM鸟苷）和2.5 mM聚阳离子Ac-F(RG)3N-NH2在pH 6下形成的共沉淀液滴（扩展数据图9c）。在第一次循环后，库的组成几乎没有变化。相比之下，第二次循环减少了甲基化和非天然核苷酸的浓度，而T和C的浓度略微增加，分别达到37%和39%。第三次循环未进一步改变库的组成（图5f）。最后，我们进行类似的实验，使用由pA组成的水凝胶代替共沉淀液滴。这些水凝胶表现出类似的纯化能力（见补充说明和补充图5）。这种单体优先连接的能力提供了一种简单的机制，通过相分离和离心纯化单体库。模板复制改变系统的物理性质
我们展示了模板作用如何影响库的组成。接下来，我们测试了是否也能出现相反的情况，即库是否能影响其环境？这种序列（如DNA或RNA）与环境（如原始细胞或细胞）之间的互相耦合，将使我们更接近探索在我们的系统中达尔文进化的可能性。例如，库的存在可能增加液滴生成后代或生存的可能性。我们通过荧光恢复光漂白（FRAP）实验测量了由pA、阳离子肽Ac-F(RG)3N-NH2和单体T或C组成的复合共沉淀液滴在加入燃料前后的荧光恢复情况。在加入燃料前，对多阴离子pA的FRAP实验显示，微米级液滴在几分钟内恢复了荧光，我们计算得出扩散常数D为6.53 × 10−5 µm² s−1。相比之下，在加入燃料后，T寡聚物的存在使扩散常数减少了大约三倍，而C寡聚物的存在使扩散常数减少了大约1.5倍（扩展数据图9d–i）。因此，内部分子粘度在燃料驱动的寡聚化过程中急剧增加，这可能与pA形成的三重螺旋有关，这些螺旋具有较大的持久长度，并作为交联剂发挥作用。对于配对错误的C寡聚物，其影响似乎较小。共沉淀液滴已知会迅速融合，这对原始细胞来说是不利的，因为它会失去其独立性。粘度的增加促使我们探索模板驱动的复制是否能减少原始细胞之间的融合。我们使用了多阴离子pDexS和pA。将它们与阳离子肽Ac-F(RG)3N-NH2和单体T混合。我们获得了由pDexS核心和pA外壳组成的多相共沉淀液滴（图6a），这些液滴从约130个多相液滴在选定区域内，经过90分钟后减少为19个液滴（图6b,c）。它们的pA外壳首先融合，然后是pDexS核心。加入燃料后，相同实验结果产生了类似的多相液滴，其中pA外壳仍然融合。然而，粘度的增加导致pDexS核心的融合显著减少，最终形成了多个pDexS核心的大的pA液滴（图6c,d）。相比之下，使用C代替T的相同实验没有减少pDexS核心的融合（扩展数据图10a）。然而，将C和T以1:1的比例混合时，恢复了保护机制，使得pDexS核心停止融合（扩展数据图10b）。Fig. 6: Microscopy analysis of coacervate
droplets.浑浊度测量（图6e）进一步验证了我们在图6b,d中展示的共聚焦数据。多相液滴的浑浊度随着其融合而衰减。相比之下，当pDexS核心的融合显著减少时，浑浊度并未衰减。值得注意的是，阳离子肽对DynT2和DynT3的浓度没有影响，但略微降低了DynT4和DynT5寡聚物的浓度（扩展数据图9j–p）。综合数据表明，基于模板的复制可以改变原始细胞的表型，在本例中是其融合的倾向。
结论
我们开发了一个化学驱动的动态组合库，以帮助揭示不稳定、含有信息的寡聚物选择机制。我们发现，杂交作用通过选择性地集中较长的寡聚物来加速寡聚化，同时通过保护机制减缓去寡聚化。这些反馈机制可以促进特定长度和序列的寡聚物，从而可以用于纯化寡聚物库。最后，我们展示了基于模板的复制如何改变共沉淀原始细胞的物理性质。信息含量序列与其隔室之间的这种耦合是我们所知生命的一个标志。通过这些模型，尽管所使用的分子在前生物学中并不具有相关性，但我们预见到可以获得关于最简生命基本机制的宝贵见解，这对于合成全新生命及其诞生时可能操作的机制具有重要意义。此外，我们的系统为大分子信息的传递提供了新工具，这些工具已经在密码学和分子数据存储等应用中证明了其价值。未来的研究将聚焦于燃料驱动的动态组合库的实用和功能性方面，并通过引入复制、突变，最终实现系统的进化，来扩大我们系统的应用范围。
样品制备方法
所有实验均在200 mM MES缓冲水中进行，pH 6（T库）或6.5（C库和混合T/C库），在25°C下使用无核酸酶的Milli-Q水（MQ水）制备。T、U、Me和Ac-F(RG)3N-NH2的库存溶液是通过将酸溶解在200 mM
MES缓冲水（pH 6）中，最终浓度为50 mM（T、U、Me）和100 mM（Ac-F(RG)3N-NH2）制备的。C、Me-T和3-pyridyl
IPA的库存溶液是通过将酸溶解在400 mM NaOH溶液中，然后加入500 mM
MES缓冲水（pH 6.5）和无核酸酶水，以最终浓度为50 mM在200 mM
MES缓冲水（pH 6.5）中制备的。所有库存溶液的pH值通过5 M氢氧化钠溶液调整为pH 6或6.5。pDexS（以单体浓度83.3 mM表示）溶解在无核酸酶的MQ水中，并通过5 M氢氧化钠溶液调整pH至6或6.5。pDexS的平均长度为42.72（以单体单位表示）。500 mM吡啶库存溶液、1 M
MgCl₂库存溶液、3 M醋酸钠和200 mM
MES缓冲水是通过分别将吡啶、MgCl₂、醋酸钠和MES水合物溶解在无核酸酶的MQ水中制备的。500 mM和200 mM
MES缓冲水的pH值通过氢氧化钠颗粒和5 M氢氧化钠溶液调整为pH 6或6.5。所有库存溶液在进一步使用之前，存储在8°C的冰箱中。EDC（500 mM或3 M）和400 mM苄胺库存溶液是通过将EDC粉末或苄胺溶解在无核酸酶的MQ水中新鲜制备的。DNA寡聚物、pA RNA（100–500 kDa）和基于RNA的聚尿嘧啶（pU；600–1,000 kDa）库存溶液是在无核酸酶的MQ水中制备的，最终浓度为100 mM（DNA）和41.3 mM（pA、pU；以单体浓度表示）。实验在2、8和25 mM的DNA浓度和0.86、2.00和4.31 mM的pA或pU浓度下进行（以单体浓度表示）。pA的平均长度为864个碱基，pU的平均长度为2200个碱基。库存溶液被分装并在-20°C的冰箱中保存，直到进一步使用。
