编辑 | 小杨
撰文 | 小杨
文献信息：
Direct cytosolic delivery of siRNA via cell membrane fusion using cholesterol-enriched exosomes
Nature Nanotechnology
本周要介绍的文章来自于中国科学院上海药物研究所俞淼荣与甘勇老师课题组。高效的细胞质递送是使用小干扰RNA（siRNA）进行治疗应用的一大挑战。本文展示了富含胆固醇的外泌体通过膜融合进入癌细胞，实现siRNA的直接细胞质递送。分子动力学模拟表明，膜的变形和与目标细胞膜的接触增加有助于膜融合。在体外实验中，富含胆固醇的牛奶来源外泌体（MEs）显示出显著更高的siRNA基因沉默效果，诱导癌细胞的凋亡效果优于原生和去胆固醇的MEs，以及传统的转染试剂。当通过口服或静脉注射给药于承载原位或皮下肿瘤的小鼠时，胆固醇富集的MEs/siRNA展现出比脂质纳米颗粒更强的抗肿瘤活性。总之，通过调节外泌体膜的胆固醇含量以促进细胞通过膜融合进入，提供了一种有前景的基于siRNA的基因治疗方法，为有效、安全和简便的基因治疗策略铺平了道路。
正文内容：
RNA干扰（RNAi）是一种强大的机制，可以使用小RNA分子（如小干扰RNA，siRNA）特异性地沉默特定基因。siRNA可以被合成设计用于靶向和降解互补的信使RNA，从而有效抑制特定蛋白质的翻译。这一策略在治疗遗传疾病和癌症等多种疾病中展现出巨大的前景。为了利用RNAi的治疗潜力，研究人员探索了纳米颗粒以递送siRNA分子。纳米颗粒通常由脂质、聚合物或其他材料组成，可以保护siRNA免受血液中降解，增强细胞摄取并促进溶酶体逃逸。然而，基于纳米颗粒的siRNA递送系统面临显著挑战，特别是在实现有效的细胞质释放和避免免疫反应方面。领先的纳米颗粒，如脂质纳米颗粒（LNPs），在将siRNA释放到细胞质中的速率仅为1-4%。此外，纳米颗粒介导的siRNA递送通常依赖于“质子海绵”效应，这可能无意中触发溶酶体破坏，导致细胞毒性和炎症。因此，需要创新的策略来克服这些限制，充分释放纳米颗粒介导的siRNA递送的治疗潜力。
与合成纳米颗粒相比，外泌体（即纳米级细胞外囊泡）作为更具生物相容性的递送载体。外泌体来自各种来源，提供了有前景的siRNA递送特性，包括延长循环时间、固有的组织靶向能力、低毒性和最低免疫原性。然而，外泌体主要通过内吞作用进入细胞，随后被困在内溶酶体内。这导致封装的siRNA在酸性和酶性内溶酶体环境中降解，从而显著影响递送效果。相比之下，自然的囊泡结构，如包膜病毒和突触囊泡，已经进化出机制，能够通过膜融合直接将货物引入细胞质，从而绕过内溶酶体的困境并优化运输效率。证据表明，包膜病毒和突触囊泡的膜具有高胆固醇含量，这是与细胞膜融合过程所必需的。受到这些观察的启发，我们假设胆固醇可能调节外泌体与细胞的相互作用，并且通过额外补充胆固醇可以重新引导外泌体的内吞途径朝向膜融合。
在本研究中，我们理论上和实验上表明，增加外泌体膜的胆固醇含量能够使其通过与细胞膜的膜融合进入细胞，从而实现高效和安全的siRNA递送。具体而言，这一现象在多种类型的外泌体中得到观察，包括富含胆固醇的牛奶来源外泌体（称为牛奶来源外泌体，MEs）和姜来源外泌体（称为姜来源外泌体，GEs），以及来自人肝癌细胞HepG2的自然富胆固醇外泌体。分子动力学（MD）模拟揭示，富含膜胆固醇的外泌体经历变形，增加与细胞膜的接触面积，最终导致膜融合。我们进一步在体外和体内研究了MEs。在细胞水平上，具有30%胆固醇修饰的siPLK1负载外泌体（30%Chol/MEs）有效抑制了PLK1 mRNA和蛋白质表达，优于阳性对照Lipofectamine 2000和RNAiMAX在诱导肿瘤细胞凋亡方面的表现。随后，我们通过口服给药和静脉注射验证了30%Chol-MEs/siPLK1在体内的有效性，显示其有效抑制了原位和异位结直肠肿瘤的生长。
外泌体与细胞膜相互作用的MD模拟
我们的初步粗粒度分子动力学（CGMD）模拟旨在确定增加外泌体胆固醇含量是否能通过膜融合改善治疗剂向细胞的递送。图1a描绘了外泌体的分子结构，由固定量的1,2-二油酸-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）、二油酸磷脂酰乙醇胺（DOPE）和硬脂酰鞘氨醇（DPSM）分子组成，但胆固醇分子的数量不同。模拟结果显示，随着胆固醇的增加，外泌体膜逐渐增厚。如图1b所示，外泌体与细胞膜的相互作用模式出现了明显的二分法：胆固醇浓度较低（0%和11%）的外泌体主要经历内吞作用，而胆固醇浓度较高（23%和30%）的外泌体则倾向于与细胞膜融合。这种相互作用模式的差异可以通过分析DOPC的径向畸变函数（RDF）来更好地理解，DOPC是外泌体中最丰富的脂质（图1c）。含有0%或11%胆固醇的外泌体的RDF模式确认了内吞作用特有的结构完整性。然而，对于胆固醇水平较高的外泌体，特别是23%和30%，RDF显示出更分散的分布。分散表明DOPC分子从外泌体迁移并与细胞膜融合。同时，胆固醇分子也从外泌体迁移，经历过渡融合阶段，最终整合入细胞膜中。
图1：胆固醇浓度对外泌体和细胞膜之间相互作用的分子动力学模拟
图1d展示了融合事件的详细视觉检查，提供了细胞膜与30%胆固醇外泌体相互作用的放大视图。序列开始时，脂质的瞬时波动和脂质双层完整性的局部扰动 precede稳定孔的形成。特别是，热运动引起的脂质包装小扰动可以导致瞬时纳米孔的形成。这些形成并不总是演变为稳定孔，但在某些条件下，如胆固醇的存在，可以作为孔形成的成核点。在外泌体与细胞膜首次接触时，在正曲率区域形成了一个微小孔（0.2 μs）。随后，胆固醇在稳定孔结构中发挥了关键作用，使得脂质交换更为高效。这种稳定性归因于胆固醇能够夹在脂质之间，从而增加膜的曲率和灵活性。此外，胆固醇分子可以通过孔逃离外泌体（0.5 μs），由于其结构较短且较刚性。当更多胆固醇分子整合入细胞膜时，其他脂质也随之而来，使外泌体与细胞膜融合（1.0 μs）。
胆固醇作为融合过程刺激剂的关键角色在能量参数的检查中显而易见。图1e和补充图1a显示了提取不同胆固醇浓度外泌体中DOPC分子进入溶液的平均势能曲线。这些值虽然是相对的，但提供了能量景观的比较分析，特别强调了胆固醇在外泌体膜中的影响。在胆固醇存在下，能量障碍显著降低，达到125 kJ mol−1，突显了其在脂质交换和融合中的促进作用。图1f和补充图1b分别展示了DOPC和胆固醇分子穿越细胞膜的转移。最初，这两种分子都表现出负自由能，表明自发融合。在施加外力后，这些能量变为正值，表明DOPC分子在从膜上脱离时遇到的能量障碍高于胆固醇。
进一步研究了更高胆固醇浓度是否同样增强外泌体与多组分膜的融合。图1g,h显示在30%胆固醇下，融合始终得以观察。模拟中的一个关键变量是细胞膜表面张力的调节，包括恒定低（0 bar）、恒定高（4 bar）和逐渐增加的张力（从0 bar到4 bar）。重要的是，含有30%胆固醇的外泌体在所有表面张力情境下成功与多组分膜融合。特别是，更高的表面张力导致脂质排列更不密集，似乎促进了融合过程。这一点得到了胆固醇扩散增加和外泌体与膜之间较高相互作用能量（绝对值）支持，如图1i所示。
胆固醇改造的乳源外泌体（Chol/MEs）的制备与表征
为了研究胆固醇对外泌体与细胞相互作用的影响，我们首先工程化了不同胆固醇水平的乳源外泌体（MEs）。原始MEs约含有18%的胆固醇（w%）。为了改变胆固醇含量，我们使用甲基-β-环糊精（MeβCD）从MEs膜中提取胆固醇，或通过薄膜水合作用法将胆固醇引入MEs膜（图2a），最终得到胆固醇含量约为5%（w%）、10%（w%）、23%（w%）和30%（w%）的工程化MEs（图2b）。这些工程化MEs的粒径约为140 nm，zeta电位为−12 mV（图2c）。透射电子显微镜（TEM）显示，MEs的杯状形态随着膜胆固醇含量的增加而逐渐减小（图2d），这可能是由于胆固醇能够稳定和增厚脂质膜。此外，在流体条件下的原子力显微镜（AFM）分析表明，所有MEs均呈球形且具有良好的单分散性（图2e）。
图2：具有不同胆固醇掺入量的外泌体的特征。
为了确认不同胆固醇掺入MEs的必要性以进行后续的生物评估，我们首先利用原子力显微镜（AFM）对MEs的弹性进行了定量评估。工程化的MEs的弹性与膜内的胆固醇浓度呈直接相关，随着膜胆固醇含量的增加，刚度显著降低，使得弹性模量从MPa范围过渡到kPa范围（图2f）。值得注意的是，胆固醇含量为30%的MEs显示出最低的杨氏模量（647 kPa）。
其次，冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）研究证实了工程化MEs的膜厚度变化，与模拟结果一致（图2g,h）。第三，我们通过西方印迹法和蛋白质组学分析分别检查了MEs中的蛋白质组分。MEs的三种蛋白标志物，包括CD63、TSG101和Alix，在不同工程化MEs中均保持存在（补充图2）。同时，通过蛋白质组学分析对细胞成分进行的全面分析显示，MEs的蛋白质组成主要与细胞膜结构相关（图2i）。值得注意的是，与膜融合潜在功能相关的蛋白质，如CD、EXOC、FOLR和SNAP蛋白，表现出统计学上显著的相关性（图2j）。综上所述，这些证据表明成功制备了胆固醇掺入不同的MEs（范围从5%到30%）。
我们使用混合的siRNA作为模型药物，研究了工程化MEs的包埋效率（EE）和负载能力（LC）。通过电穿孔法，siRNA有效地加载到工程化MEs中，EE约为75%，LC约为4.0%（补充图3和补充表1）。此外，我们验证了工程化MEs的良好安全性和稳定性（补充图4和5），表明这些工程化MEs将成为体内应用的安全且稳定的递送系统。
胆固醇富集的MEs通过膜融合进入癌细胞
接下来，我们研究了工程化MEs的细胞摄取能力。显然，荧光共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结果和流式细胞术分析显示，人结肠癌细胞（HCT116细胞）对MEs的摄取随着膜胆固醇的增加而增加（补充图6a,b）。具体而言，30%Chol/MEs与5%Chol/MEs、10%Chol/MEs、18%Chol/MEs和23%Chol/MEs相比，摄取量分别提高了4.0倍、3.5倍、2.0倍和1.6倍（补充图6c）。
先前的研究表明，不同的细胞摄取机制会导致不同的摄取效率，而与高能依赖的内吞途径相比，融合是一种低能耗的途径，可以促进细胞摄取。我们因此假设胆固醇富集的MEs可能通过膜融合被HCT116细胞内化。为了验证这一假设，CLSM观察显示30%Chol/MEs的红色信号几乎与细胞膜的绿色信号重叠（图3a），表明30%Chol/MEs可以与癌细胞膜融合。相反，在原始MEs和胆固醇耗竭MEs组中没有明显的共定位现象（图3a）。此外，膜融合过程在实时监测中显示，如图3b和补充视频1、2所示，30%Chol/MEs的红色信号逐渐与细胞膜（绿色）合并，表明30%Chol/MEs与HCT116细胞膜融合。对于5%Chol/MEs，它们附着在细胞膜上，随后被囊泡包裹，最终运输到细胞质中。
为了进一步验证机制，HCT116细胞在预处理时使用了多种内化抑制剂。如图3c所示，细胞预处理显著减少了原始MEs和胆固醇耗竭MEs组的细胞内内化，而对胆固醇富集的MEs的摄取减少幅度较小。对荧光共振能量转移（FRET）实验的附加分析确认了30%Chol/MEs与HCT116细胞之间的融合（图3d,e和补充图7），而在2小时内的平均融合效率约为57.8%（图3f）。透射电子显微镜（TEM）图像进一步验证了30%Chol/MEs与HCT116细胞之间的膜融合（图3g和补充图8）。这些结果表明，胆固醇富集的MEs的摄取主要依赖于膜融合。
图3：不同胆固醇水平的外泌体通过不同的内化途径进入细胞。
膜融合后，胆固醇富集的MEs表现出直接将内部货物运输至细胞质的潜力，从而规避内吞-内体路径。相反，胆固醇耗竭的MEs在内吞后往往被封闭在内体内。为了区分不同的细胞内运输途径，我们将MEs与表达EGFP标记的Rab5Q79L的细胞孵育，该蛋白作为早期内体的标志物。我们在早期内体中检测到了内化的5%Chol/MEs（图3h）。相比之下，30%Chol/MEs在早期内体中显著缺失。同时，CLSM图像显示，5%Chol/MEs与溶酶体的显著共定位（补充图9），强调了内吞后涉及内体-溶酶体路径的作用。为了进一步描绘空间分布，我们使用罗丹明B标记MEs的内部水相，并在与HCT116细胞孵育后进行了三维（3D）成像。结果显示，30%Chol/MEs发出的红色荧光均匀分布在整个细胞内（图3i和补充视频3、4），表明通过膜融合实现了30%Chol/MEs货物的细胞质递送。这一模式与5%Chol/MEs组形成鲜明对比，后者在细胞内可见红点，表明被困在细胞内腔。
膜融合介导的摄取观察到与胆固醇水平相关，这不仅适用于MEs，也适用于GEs。我们还调查了不同胆固醇水平的GEs的摄取路径，结果显示，胆固醇富集的GEs在癌细胞中的摄取也主要依赖于膜融合（补充图10）。
此外，我们研究了工程化MEs在其他癌细胞中的细胞摄取，包括人肝细胞癌细胞（HepG2细胞）、人宫颈癌细胞（HeLa细胞）、人卵巢癌细胞（SK-OV-3细胞）和小鼠乳腺癌细胞（4T1细胞），以及正常细胞，包括肠上皮细胞（NCM460细胞）、人胚肾细胞（293T细胞）和小鼠海马神经元细胞（HT22细胞）。与HCT116细胞的结果一致，胆固醇富集的MEs在HepG2、HeLa、SK-OV-3和4T1细胞中的摄取主要依赖于膜融合途径（补充图11a–d）。然而，在正常细胞（包括NCM460、293T和HT22细胞）中，我们观察到不同的模式。随着胆固醇掺入增加，工程化MEs与细胞膜之间没有显著共定位（补充图11e,f和12a）。所有工程化MEs组都通过以内吞为基础的途径内化（补充图11e,f和12b）。综上所述，我们对工程化MEs在一系列癌细胞和正常细胞系中的细胞摄取进行了全面调查，揭示了胆固醇富集MEs的摄取机制存在显著差异。这些观察为潜在的靶向治疗应用在癌症治疗中的重要性提供了有意义的见解。
合成不同胆固醇掺入比例的脂质体
接下来，我们根据MD模拟中的磷脂成分合成了不同胆固醇掺入的脂质体。观察到随着脂质体中胆固醇含量的增加，脂质体中红色信号与细胞膜中的绿色信号的共定位显著增加（补充图13a）。进一步的FRET实验确认了30%Chol/Lipo与HCT116细胞之间的融合得到促进（补充图13b）。虽然胆固醇掺入显著增强了膜融合效率，但这种增强可能受到其他因素和路径复杂相互作用的影响。这系列实验不仅阐明了胆固醇含量对脂质体与细胞膜相互作用的影响，还建立了MD模拟与实验结果之间的联系，从而增强了我们对膜融合过程的理解。
研究天然外泌体的胆固醇水平
此外，我们的研究扩展到不同胆固醇水平的天然外泌体，消除了对工程技术的需求。我们利用从HepG2细胞（已知其胆固醇含量高达27.9%）和CT26细胞（其胆固醇含量较低，为8.6%）提取的外泌体进行分析。通过荧光共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和抑制剂研究的综合分析显示，外泌体的摄取机制与膜胆固醇含量相关。HepG2细胞衍生的外泌体主要通过膜融合进入癌细胞（补充图14a,b），这一过程受到其较高胆固醇含量的促进。相反，CT26细胞衍生的外泌体则主要通过内吞方式被内化（补充图14c,d）。这些结果进一步强化了我们之前对工程化外泌体和脂质体的观察，并提供了胆固醇在决定细胞摄取路径中关键作用的进一步证据。
胆固醇富集的MEs提高体外siRNA基因沉默效果
通过膜融合进入细胞后，胆固醇富集的MEs能够直接将加载的siRNA释放到细胞质中，从而绕过内体-溶酶体的困境。我们监测了包封的Cy3-siRNA的细胞内命运。结果显示，只有少量加载在30%Chol/MEs中的siRNA与溶酶体共定位，表明其溶酶体困境有限。相对而言，5%Chol/MEs组中的大量siRNA与溶酶体显示出显著的共定位。类似地，5%Chol/MEs组中的siRNA与内质网（ER）共定位的比例较小，而30%Chol/MEs组中的siRNA则与内质网明显共定位（图4a和补充图15）。这些观察结果暗示，30%Chol/MEs主要通过膜融合进入细胞，能有效地将siRNA直接释放到细胞质中，并使其到达内质网以实现功能效应。
图4：装载siPLK1的的外泌体在体外可有效抑制hct116细胞的生长
接下来，我们评估了加载siRNA的MEs在HCT116细胞中对PLK1基因的沉默效率，以PLK1-siRNA作为靶基因，具有合成致死效应。实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）结果显示，与空白组相比，裸siPLK1处理组PLK1 mRNA水平无显著变化。显著地，30%Chol/siPLK1组的PLK1 mRNA下调幅度达到84.1%，相较于5%Chol/siPLK1、10%Chol/siPLK1、Lipo2000/siPLK1、18%Chol/siPLK1、RNAiMAX/siPLK1和23%Chol/siPLK1，分别显示出5.3、2.9、2.4、1.5、1.5和1.2倍的降低（图4b）。相应地，西方印迹结果证实，30%Chol/siPLK1组的PLK1蛋白水平抑制约60%（图4c）。更重要的是，30%Chol/siPLK1组相较于其他siRNA加载的配方表现出显著的增殖抑制（图4d）。细胞凋亡结果的定量分析显示，处理30%Chol/siPLK1的HCT116细胞凋亡细胞比例为29.2%，包括早期和晚期凋亡细胞（Q2 + Q3）（图4e、f及补充图16a），显著高于RNAiMAX/siPLK1组的19.0%。此外，细胞周期阻滞的评估显示G2/M期细胞的百分比如图4g和补充图16b所示。显著地，30%Chol/siPLK1组表现出G2/M期细胞的最高比例。这些发现表明，30%Chol/siPLK1作为RNAi治疗平台的前景广阔，其效果优于商业化的转染试剂。
siPLK1加载的胆固醇富集MEs延缓肿瘤生长
为了探讨siPLK1加载的MEs在癌症治疗中的应用，我们进一步研究了其在皮下结肠癌模型中的抗肿瘤活性。IVIS光谱成像系统的结果显示，DiR标记的MEs在尾静脉注射后24小时特异性靶向肿瘤（补充图17）。在癌症治疗中，将HCT116结肠癌小鼠随机分为九组。不同的配方在21天内每三天进行一次静脉注射（图5a）。记录肿瘤体积和体重。最后，对所有组的主要器官进行了组织切片的苏木精-伊红（H&E）染色的组织病理分析。显著地，体重或组织切片的组织病理组成未出现明显变化，突显出工程化MEs良好的安全性（图5b及补充图18）。此外，天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6水平未见显著变化（补充图19），表明工程化MEs在体内具有良好的安全性和低免疫原性。
图5：装载siPLK1的外泌体能有效根除结直肠肿瘤
在实验结束时，所有小鼠均被处死，肿瘤被切除并称重。使用30%Chol/siPLK1、18%Chol/siPLK1和5%Chol/siPLK1处理的肿瘤与PBS组相比，体积分别减小约7.3倍、4.1倍和2.8倍（图5c）。其中，30%Chol/siPLK1组显示出几乎完全的肿瘤生长抑制（图5d）。相比之下，PBS组、裸siRNA组、siRNA/电穿孔组及未加载siRNA的MEs组肿瘤生长迅速，而5%Chol/siPLK1、18%Chol/siPLK1或30%Chol/siPLK1的治疗显著减少了肿瘤体积（图5e及补充图20）。通过H&E染色分析细胞凋亡，裸siRNA处理的肿瘤切片显示出明显的细胞核和细胞质，类似于PBS组。相反，30%Chol/siPLK1组则显示出细胞核收缩和细胞外间隙增加的迹象，表明肿瘤细胞凋亡增强（图5f）。此外，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）实验显示，30%Chol/siPLK1组肿瘤细胞中存在显著的DNA断裂（图5g）。这些结果表明，胆固醇富集的MEs能够成功将siPLK1递送至靶癌细胞，有效抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，从而最终抑制肿瘤进展。
进一步探索siPLK1加载的MEs的治疗潜力
为进一步探索siPLK1加载的MEs的治疗潜力，我们建立了正位结肠癌（CRC）小鼠模型。小鼠肿瘤的生物荧光强度相似，随后分为五组。IVIS光谱成像显示，Cy5.5-siRNA标记的MEs与表达荧光素酶的肿瘤细胞显著共定位，证明了工程化MEs能够在口服给药24小时后保留在结肠并被结肠癌细胞摄取（补充图21）。随后，每组小鼠每天口服含有100μg/kg siPLK1的制剂，持续14天（图6a）。在治疗期间，小鼠体重相似，H&E染色显示所有组主要器官未见显著组织学毒性，与对照组相比表明良好的生物相容性（图6b及补充图22）。此外，通过生物荧光成像监测肿瘤生长（图6c）。与PBS处理组类似，LNP/siPLK1未能延缓肿瘤生长（图6d）。相比之下，5%Chol/siPLK1和18%Chol/siPLK1表现出显著的肿瘤生长抑制（图6d）。值得注意的是，30%Chol/siPLK1组的小鼠肿瘤出现缩小，展现出最强的抗肿瘤效果（图6d）。
图6：装载siPLK1的外泌体能有效根除原位结直肠肿瘤
在实验结束时，小鼠被安乐死，肿瘤被切除。接受5%Chol/siPLK1、18%Chol/siPLK1和30%Chol/siPLK1处理的肿瘤分别比PBS组小约1.4倍、1.7倍和3.8倍（图6e）。值得注意的是，PBS组的肿瘤出现了转移到多个器官的现象（图6f），显示出这种恶性肿瘤的侵袭性。然而，在MEs/siPLK1治疗组中并未观察到这种转移，突显了这些制剂在抗肿瘤扩散方面的治疗潜力。H&E染色进一步显示，当PLK1被敲低时，结直肠癌的显著减少。用LNP/siPLK1处理的肿瘤切片与PBS组类似，保持了明显的细胞核和细胞质，而MEs/siPLK1组则显示出细胞核萎缩和细胞外空间增加，表明肿瘤细胞的凋亡更加有效（图6g）。总的来说，这些结果证实了胆固醇富集的MEs能够有效递送siPLK1，从而有效抑制结直肠癌的生长。
结论：
总之，本研究在siRNA基因治疗领域取得了重要进展，提出了一种通过胆固醇富集的外泌体进行siRNA递送的新方法。通过实现膜融合，能够绕过内体捕获，从而提高siRNA递送效率。与一些合成纳米颗粒和融合剂相比，胆固醇富集的外泌体具有更好的生物相容性，且不易引发不必要的免疫反应，这对安全基因治疗策略的开发至关重要。因此，通过调节外泌体膜中的胆固醇含量，以促进膜融合介导的货物转移，为创建更安全、更有效的基因治疗平台提供了令人兴奋的机遇。
方法：
分子动力学模拟
使用GROMACS 2021.3软件包和Dry Martini粗粒度分子动力学（CGMD）模拟，研究细胞膜与外泌体之间的相互作用。该模型通过减少粒子数量而保持溶剂效应，尤其适合研究膜内脂质-脂质或脂质-蛋白质的相互作用。
外泌体的分离
新鲜牛奶样本在2500 × g和4 °C下离心30分钟，以分离细胞和细胞残留物。去脂样本用30 mM EDTA处理并在37 °C下孵育1小时，以螯合酪蛋白-钙复合物，随后通过超离心步骤分离牛奶外泌体（MEs）。最后的沉淀物在PBS中重悬并储存于-80 °C。
外泌体的纯化
为纯化通过差速离心分离的MEs，制备了不连续的碘索糖梯度。MEs被层叠到该梯度上，并在100,000 × g下超离心18小时。然后，MEs被洗涤并如上所述储存。
牛奶外泌体胆固醇水平的调节
通过使用MeβCD进行胆固醇去除来调节胆固醇水平，而胆固醇富集则涉及将MEs与干胆固醇薄膜重悬，随后进行超声和离心。胆固醇含量使用Amplex Red试剂盒按制造商说明进行定量。
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