J. Am. Chem. Soc：体内自组装的原位纳米疫苗呈递技术
文摘
科学
2024-08-19 13:28
浙江
编辑 | 小杨
撰文 | 小杨
文献信息：
In
Situ Polymerization-Mediated Antigen PresentationJournal
of the American Chemical Society本周要介绍的文章是来自于上海交通大学刘尽尧团队的工作。刘尽尧的主要研究方向包括开发新型生物医用高分子的可控制备、智能仿生材料的生物合成新方法，肿瘤的诊断、成像和治疗新策略。激活抗原呈递细胞是产生适应性免疫的关键，而传统激活策略的效果常因抗原特异性启动不足而不尽如人意。本文描述了一种原位聚合介导的抗原呈递（IPAP）策略，其中，负载抗原的纳米疫苗通过与多巴胺的共同沉积，在体内自发形成并高效锚定于树突状细胞表面。化学结合的纳米疫苗能够通过提升基于大吞噬作用的细胞摄取和减少溶酶体相关抗原降解来促进抗原呈递。IPAP不仅能够延长抗原在注射部位的储留时间，还能增强其在引流淋巴结中的后续积累，从而诱发强大的抗原特异性细胞免疫和体液免疫反应。IPAP适用于不同抗原，并能够克服复杂制备与纯化的缺点。以卵清蛋白为例，IPAP在预防性小鼠模型中对卵清蛋白过表达肿瘤细胞挑战引发了显著的保护性免疫。使用SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基还显著增加了小鼠中S1特异性免疫球蛋白G的生成。IPAP提供了一种独特的策略，通过激活抗原呈递细胞来增强抗原特异性适应性反应，并提出了一种简便而多功能的免疫接种方法，用于对抗多种疾病。抗原呈递细胞（APCs）在对抗肿瘤和感染等多种疾病的过程中，协调着细胞免疫和体液免疫的发生。APCs，尤其是树突状细胞（DCs），捕获、处理和呈递抗原，是适应性免疫的基石。 然而，由于缺乏病原体相关的分子模式，来源于蛋白质的亚单位抗原无法被APCs识别，并且迅速被网状内皮系统清除。为促进APCs对抗原的摄取，诸如脂质体、微球和纳米颗粒等药物载体已广泛应用于包裹和递送抗原。 在这些载体的帮助下，APCs捕获、淋巴结引流以及在被APCs内化之前保护抗原不被降解方面，相较于传统方法已有多项优势得到了验证。此外，通过功能化特定配体，药物载体可以被赋予主动靶向能力，从而进一步提高抗原递送至APCs的效果。 尽管这些成就令人瞩目，但载体的有限装载效率、低产率以及与费时的制备和纯化相关的高成本限制了这些递送系统的广泛应用。此外，药物载体与APCs之间通过被动内吞或超分子配体-受体结合的弱相互作用可能导致抗原摄取和呈递不足。因此，能够有效成熟APCs以激发抗原特异性保护性免疫的简单策略是高度渴望的。近年来，利用生物界面修饰活细胞以引入外源功能的进展，提供了操纵细胞行为的替代策略。在这些方法中，通过非共价相互作用或共价偶联将功能基元引入细胞表面已被用来调控多种免疫细胞，如T细胞、DCs和巨噬细胞。特别是与细胞表面的共价偶联的稳定性可以提供引入功能的更长持续时间，从而延长对细胞行为的调控。例如，通过马来酰亚胺-硫醇偶联将负载细胞因子的纳米颗粒偶联到T细胞表面，可持久地为转移的T细胞提供体内动力。此外，通过双亲生物反应在膜结合的卤素标记蛋白和氯烷烃之间修饰DCs上的糖聚合物，能够提高DC-T细胞的吸引力，从而增强T细胞的激活。 然而，据我们所知，利用生物界面修饰活细胞以促进APCs的抗原递送和呈递的报道较为罕见。这主要是由于以往方法在体内实施的可行性较低，通常需要严格的修饰条件，而非复杂的体内环境。聚多巴胺（PDA）是一种受到贻贝黏附蛋白启发的合成生物材料，通过多巴胺的自发氧化和自聚合即可简单制备。具有优异生物相容性和生物降解性的PDA已广泛应用于不同的生物医学领域，如组织工程、生物传感、生物成像和药物递送。值得注意的是，在多巴胺聚合过程中，所得PDA中丰富的胺基、醌基和α,β-不饱和酮基提供了理想的锚点，可通过酰胺化、Michael加成和/或Schiff碱反应在各种生物界面上偶联其他功能分子。例如，在牙组织表面涂覆PDA可诱导牙本质和牙釉质的再矿化，并且没有明显的副作用。此外，在胃肠道腔内表面沉积PDA已被用于形成局部药物递送的合成生物材料层，其中负载的治疗剂可以持续释放到小肠。因此，原位多巴胺聚合为体内修饰APCs提供了一种可行且简单安全的工具，有可能改善抗原的递送和呈递。本文报道了原位聚合介导的抗原呈递（IPAP），在此过程中，抗原可与多巴胺共同沉积在体内自发形成，并且形成的基于PDA的纳米疫苗可高效附着在皮下DCs表面（方案1）。通过共价键介导的吞噬途径，IPAP增加了DCs对抗原的摄取，并通过减少与溶酶体相关的抗原降解促进了抗原的呈递。更重要的是，IPAP显著延长了抗原在注射部位的储留时间，导致在引流淋巴结中的抗原暴露增强。经皮下注射后，IPAP能够强力促进体液和细胞免疫反应。IPAP还适用于不同抗原，因为多巴胺能够与多种功能结构共同沉积，并且能够避免传统疫苗开发方法中多步制备的限制。为了概念验证应用研究，我们将IPAP用于肿瘤免疫治疗和抗病毒免疫的两种临床情景。我们证明，通过使用卵清蛋白（OVA）模型抗原，IPAP触发了强大的抗原特异性T细胞反应，抑制了OVA过表达的B16-OVA黑色素瘤并延长了小鼠的存活期。通过替换为SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基，IPAP显著增强了B细胞反应，促进了小鼠中S1特异性免疫球蛋白G（IgG）抗体的表达。我们期望IPAP为抗原递送和呈递开辟一扇窗口，并为肿瘤和传染病的疫苗接种提供一种简便且通用的平台。原位纳米疫苗的形成和在树突状细胞（DC）表面的沉积由于抗原蛋白中存在亲核的巯基和氨基，这些蛋白可能在多巴胺的氧化自聚过程中，通过Schiff碱和/或Michael加成反应沉积下来。为了研究负载抗原的聚多巴胺纳米颗粒的形成，在一种适合细胞的条件下，通过将多巴胺与抗原蛋白简单混合在水溶液中进行了聚合反应。我们在37°C下将0.5 mg/mL的多巴胺与1.5 mg/mL的卵清蛋白（OVA）混合于磷酸盐缓冲液（PBS）中，反应2小时后，通过离心纯化得到的纳米颗粒。透射电子显微镜（TEM）图像显示，在未加入OVA的情况下，形成的PDA为球形纳米颗粒，表面相对光滑，平均粒径约为198 nm（图1a和图S1）。在与OVA混合后，所得的OVA负载纳米颗粒（OVANPs）显示出粗糙的表面，粒径增大至约269 nm。与PDA相比，OVANPs在紫外-可见（UV-vis）光谱中呈现出490 nm处的特征峰，该特征峰归因于FITC标记的OVA的吸收（图S2）。OVANPs的负载能力和效率分别计算为31%和9%。通过使用FITC标记的OVA（OVA-FITC），制备的OVANPs在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像中显示出明显的荧光信号（图S3），进一步验证了在细胞培养条件下，仅通过与多巴胺简单混合，即可在PDA纳米颗粒中成功沉积OVA。![]()
我们将0.5
mg/mL的多巴胺与1.5 mg/mL的卵清蛋白（OVA）添加到DC2.4细胞的培养基中，并在37°C下孵育6小时。扫描电子显微镜（SEM）观察显示，DC表面出现了粗糙的纳米颗粒结构（图1b）。这种结果中的OVA纳米疫苗沉积的DC（ONDCs）表面结构与单纯的OVA孵育的DCs（ODCs）明显不同，后者显示为正常的均匀细胞表面。OVA-FITC还用于ONDCs的可视化和定量研究。CLSM成像表明，ONDCs而非ODCs的表面周围存在荧光信号（图1c），说明了OVANPs的附着。ONDCs切片的TEM成像进一步证实，OVANPs主要沉积在DC的表面而非内部（图S4）。与PBS和ODCs组相比，流式细胞术直方图显示ONDC组向更高荧光强度显著偏移（图1d）。定量分析证实，ONDC组的平均荧光强度（MFI）分别是PBS和ODCs组的5.8倍和2.4倍（图1e）。计算得出，1 × 10^5个DC2.4细胞分别携带了43.7 μg的OVA和97.2 μg的PDA。此外，随着多巴胺浓度增加到0.5
mg/mL，对DC2.4细胞几乎没有观察到细胞毒性，反映了对DCs原位聚合的良好细胞相容性（图1f,g）。这些数据表明，通过简便且细胞相容的原位多巴胺沉积过程，成功在DC表面形成并沉积了负载抗原的纳米疫苗。众所周知，DCs对抗原的摄取对启动适应性免疫至关重要。为了研究DCs在原位聚合过程中对抗原的摄取情况，在与0.5 mg/mL的多巴胺和1.5 mg/mL的OVA共同孵育一段时间后，对DC2.4细胞进行了CLSM和流式细胞术分析。如图1h所示，联合培养10小时后，在ONDCs中观察到了可见的OVA-FITC荧光信号，而在ODCs中仅观察到有限的FITC信号。随着孵育时间延长至20小时，在ONDCs内部可视化到与OVA-FITC相关的强荧光信号，远强于ODCs，暗示了原位共沉积在DC表面显著提高了抗原摄取的效果。定量分析表明，内部化OVA的ONDCs的比例（约89%）是ODCs（约18%）的4.9倍（图1i和图S5）。为揭示ONDCs促进抗原摄取的潜在机制，我们使用氯丙嗪（一种抑制网格蛋白介导的内吞作用的抑制剂）、非利潘（一种抑制小窝依赖性内吞作用的抑制剂）和氨力农（一种抑制大吞噬作用的抑制剂）来研究内吞途径。与共聚焦成像结果一致（图1j），流式细胞术分析显示细胞摄取在氨力农组中显著减少（图1k）。这些结果揭示，ONDCs主要通过大吞噬途径内化抗原，这可能是由于OVANPs与DC表面之间的共价结合所致。相比之下，已有报道表明，预制的PDA纳米颗粒通过小窝依赖性内吞和大吞噬途径同时被内化。简言之，通过原位聚合的多巴胺共沉积能够显著增强DCs对抗原的摄取，且主要通过特殊的大吞噬途径。DCs的成熟对于抗原呈递和随后的免疫反应的启动至关重要。为评估ONDCs的成熟情况，我们检查了细胞表面共刺激分子CD80和CD86的表达。将从小鼠中分离的骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）与最佳浓度的多巴胺（0.5 mg/mL）和OVA（1.5 mg/mL）共同培养20小时。流式细胞术轮廓图和定量分析显示，CD80+CD86+ ONDCs的比例显著高于CD80+CD86+ ODCs（图2a,b），说明通过多巴胺聚合在细胞表面原位沉积OVA可有效诱导DC成熟。需要注意的是，成熟的DCs会大量分泌炎症性细胞因子，这有助于调动适应性免疫系统。与此一致，与其他组相比，ONDCs显著上调了肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）和白介素-6（IL-6）的产生（图2c–e），进一步确认了DC成熟的诱导。值得注意的是，多巴胺孵育的DCs（DDCs）相比PBS组表现出TNF-α和IFN-γ的分泌增加（图2c,d），表明DC表面形成的PDA纳米颗粒可作为佐剂发挥作用。如预期的那样，ONDCs在细胞表面展示了最高水平的SIINFEKL肽（图2f,g），证实了显著提高的交叉呈递效率。更重要的是，ONDCs在成熟和抗原呈递能力上明显优于与预制的OVANPs孵育的DCs（图S6）。这些结果表明，由于增强的抗原摄取和PDA纳米颗粒在细胞表面形成的潜在佐剂作用，原位共沉积能够有效刺激DC的成熟和交叉呈递。为了理解促进交叉呈递和DC成熟的原因，我们测试了原位共沉积后OVA-FITC的细胞内定位。众所周知，内吞抗原在DC细胞质中的定位对抗原的处理和呈递有着至关重要的影响。同时，一旦抗原被运输到早期/晚期内涵体而不是降解性的溶酶体中，交叉呈递就会得到促进。如图2h,i所示，细胞质内大部分内化的OVA-FITC定位于早期内涵体抗原1（EEA1）阳性的早期内涵体中，而未与溶酶体共定位，这表明通过原位共沉积递送的抗原能够有效逃逸内涵体-溶酶体途径。相比之下，DCs内化的几乎所有游离的OVA-FITC最终都被运输到溶酶体中进行过度降解（图2i）。综上所述，通过在DC表面原位聚合与多巴胺共沉积抗原，可以通过促进大吞噬途径介导的抗原摄取和减少溶酶体介导的抗原降解来增强抗原的交叉呈递。考虑到皮下组织中的缺氧环境会显著抑制多巴胺的氧化和自我聚合， 我们采用酶催化聚合来实现体内的原位聚合抗原呈递。已有报道指出，过氧化氢（H2O2）在过氧化氢酶（CAT）的催化下分解，能够显著加速多巴胺的聚合速率，这主要取决于氧气浓度。我们首先在模拟皮下组织低氧分压的缺氧环境中，检测了是否添加H2O2和CAT对聚合速率的影响（图3a）。与单独使用多巴胺相比，添加微量H2O2或CAT并未明显促进聚合（图3b）。正如预期的那样，在同时添加H2O2和CAT后，多巴胺溶液迅速变为深棕色，表明聚合速率显著加快。多巴胺快速聚合的原因可以归因于CAT催化H2O2生成分子氧。为了量化H2O2和CAT对聚合速率的影响，我们通过测量反应溶液在700 nm处的吸光度来比较聚合动力学，这代表了聚多巴胺（PDA）的形成。在所有反应条件中，添加H2O2和CAT后信号强度迅速上升，在10分钟内显示出大约70倍的增长（图3c）。使用H2O2和CAT证明了在缺氧条件下高效的多巴胺聚合。![]()
接下来，我们通过酶催化聚合，在小鼠皮下免疫后评估了体内DC表面纳米疫苗的原位形成和沉积。我们制备的注射溶液包含1.5
mg/mL的OVA-FITC、0.5
mg/mL的多巴胺、20 mM的H2O2和0.025
mg/mL的CAT，并命名为ODHC。将ODHC注射到小鼠右侧腰部皮下。相应的PBS、OVA-FITC和OVA-FITC与多巴胺的混合物（称为OD）作为对照组单独使用。正如预期的那样，与所有对照组不同，免疫后30分钟内，ODHC组的小鼠皮下组织肉眼可见地变成深棕色，表明注射部位成功实现了原位聚合（图3d和图S7）。与自由状态的OVA相比，形成的OVANPs在注射部位表现出显著延长的滞留时间，体现在皮下免疫后通过体内成像系统监测到的FITC荧光信号（图3e）。具体而言，OVA组的信号随时间迅速减弱，注射后3小时几乎消失，而ODHC组在7小时后仍能保持45%的荧光强度（图3f）。为了验证体内OVANPs在DC表面的原位沉积，免疫后10小时切取皮下组织，并使用Hoechst
3342和CD11c抗体进行染色以识别DCs。与PBS和OD组相比，ODHC组招募了大量的DCs，并显示出OVA和DCs高度共定位，表明注射的抗原成功沉积到DC表面（图3g和图S8）。此外，观察到ODHC组采集的腹股沟引流淋巴结（DLNs）中的荧光信号也高于OD组，这归因于OVA负载DCs的迁移（图S9）。我们接着研究了体内IPAP是否能够有效刺激DC成熟并促进交叉呈递。为此，我们每7天免疫小鼠一次，连续三次，并在最后一次免疫后第三天将其安乐死。采集引流淋巴结（DLNs）以检测DC的交叉呈递和CD8+ T细胞的交叉激活（图4a）。与体外结果一致，体内IPAP显著促进了DC成熟（图4b,c和图S10a）。接种ODHC的小鼠显示出所有处理组中CD80+和CD86+成熟DC的最高比例。同时，从接种ODHC的小鼠中采集的DC上主要组织相容性复合体II（MHC-II）的表达也最高，MHC-II是适应性免疫反应的关键调节因子（图S11）。值得注意的是，与OVA组相比，从OD组收集的DCs中交叉呈递没有显著增加，这可能是由于皮下缺氧组织中多巴胺聚合受抑所致（图4d,e）。令人惊讶的是，ODHC治疗显著增加了SIINFEKL呈递DCs的比例，表明体内IPAP增强了交叉呈递。此外，与接种OVANP的小鼠相比，接种ODHC组中的CD80+CD86+成熟DCs和SIINFEKL呈递DCs分别增加了约1.3倍和1.7倍（图S12）。进一步研究了DLNs中的OVA特异性T细胞免疫反应。正如图4f,g和图S10b所阐明的，SIINFEKL-MHC-I四聚体+CD8+ T细胞的频率在ODHC组中较OVA和OD组显著增加。这一结果证明，体内IPAP成功增强了DC介导的T细胞适应性免疫反应。需要注意的是，效应CD8+ T细胞通常被认为会产生大量的IFN-γ，这可以直接增强抗病毒和抗肿瘤免疫反应。实际上，与OVA组相比，接种ODHC的小鼠引流淋巴结中的IFN-γ+CD8+ T细胞的比例增加了3倍（图4h,i）。ODHC处理的小鼠血清中的TNF-α和IFN-γ水平也显著上调（图S13），表明引发了强烈的系统性免疫反应。此外，免疫组织学图像显示出显著的生发中心形成（图4j），这暗示着B细胞克隆扩展和抗体亲和力成熟主要发生在生发中心（GL7+B220+细胞）中，提示体液免疫反应的有效启动。综上所述，体内IPAP能够通过促进交叉呈递和启动B细胞免疫反应，有效引发抗原特异性T细胞免疫反应。![]()
为了验证IPAP的多功能性，我们将OVA替换为SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基的病毒抗原。我们首先通过原位聚合进行了S1亚基与多巴胺的沉积。S1负载的纳米颗粒容易形成，平均尺寸为102 ± 19 nm，zeta电位为−4.65 ± 1.70 mV（图5a,b和图S14）。相应的负载量和效率分别计算为29%和10%。类似地，我们将0.5 mg mL–1多巴胺和1.5 mg mL–1 S1蛋白加入到DCs培养基中。S1蛋白纳米疫苗沉积的DCs（SNDCs）的SEM图像显示了与ONDCs类似的粗糙细胞表面（图5c）。制备了包含1.5 mg mL–1 S1蛋白、0.5 mg mL–1多巴胺、20 mM H2O2和0.025 mg mL–1 CAT的溶液，并命名为SDHC用于体内IPAP。将注射等量PBS、S1蛋白（SP）和多巴胺与R848激动剂混合物（DR）的DLNs进行收集，并在注射后21天进行均质化处理，以分析B细胞上CD69的表达，CD69是B细胞的早期激活标志物，对诱导抗体介导的免疫反应至关重要。显著的是，SDHC组B细胞上CD69的表达明显高于SP和DR组（图5d,e）。与对照组相比，SDHC组小鼠中DCs表达的CD80和CD86的平均荧光强度也更高（图5f,g），表明DCs的抗原呈递功能得到激活。值得一提的是，T细胞介导的免疫在预防SARS-CoV-2感染中起着关键作用。具体来说，CD8+ T细胞可以被吸引到感染部位以杀死入侵的细胞，而CD4+ T细胞促进B细胞激活并产生细胞因子。图5h显示，SDHC组DLNs中CD3+ T细胞的Ki67表达显著高于其他组。此外，SDHC组CD4+和CD8+ T细胞中的Ki67表达和IFN-γ产生也表现出最高水平（图5i–m）。这些增加表明了T细胞激活和增殖的促进作用，以及可能由DCs的MHC-I和MHC-II呈递S1表位。此外，SDHC注射组的血清中IFN-γ和IL-6分泌量上调（图5n,o），支持了通过病毒抗原与多巴胺的原位共沉积引发的强效系统性抗病毒免疫反应，众所周知，IFN-γ在细胞介导的免疫中发挥着重要作用，通过激活巨噬细胞和抵御多种病原体，而IL-6则有助于诱导B细胞分化为免疫球蛋白产生细胞。总的来说，体内IPAP可以放大体液和细胞免疫，并适用于多种抗原。![]()
为了评估IPAP的抗肿瘤潜力，我们在最后一次免疫3天后用表达OVA的B16-OVA黑色素瘤肿瘤细胞攻击小鼠，并进行皮下注射免疫（图6a）。单独使用OVA仅略微延缓了肿瘤的生长（图6b,c），这反映了游离抗原的免疫原性较弱。OD免疫的小鼠的保护效果仍然不理想（图6b,c），这可能归因于低氧皮下组织中多巴胺和OVA共沉积不足。然而，一旦使用了ODHC，肿瘤的生长就得到了有效抑制，相应的小鼠生存期显著延长（图6b,c和图S15）。我们在治疗期间监测了小鼠的体重，所有组别中小鼠体重没有显著差异，表明体内IPAP具有良好的安全性（图6d）。通过苏木精-伊红（H&E）染色的组织学检查显示，所有免疫小鼠的主要器官中都没有检测到损伤（图6e），进一步支持了体内IPAP的高耐受性。除了抗癌作用外，我们还通过检测抗SARS-CoV-2 S1 IgG抗体的产生来评估体内IPAP的抗病毒价值。小鼠分别在第0天和第14天皮下注射PBS、SP、DR或SDHC（图6f）。在第0天、第7天、第14天和第21天收集血清样本进行抗体分析。在初次和加强免疫后，SDHC组在第7天、第14天和第21天诱导了显著更高滴度的抗S1 IgG抗体，明显高于所有对照组（图6g），表明产生了具有保护性的抗病毒免疫。这些结果表明，体内IPAP成功地引发了针对肿瘤和病毒攻击的强效保护性免疫反应。总之，我们报道了一种体内IPAP策略，在该策略中，抗原可通过多巴胺的自发原位氧化和自我聚合形成基于PDA的纳米疫苗，有效共沉积在皮下树突状细胞（DCs）表面。IPAP能够通过共价键辅助的大吞噬作用途径促进DCs对抗原的内化，并通过促进内体逃逸和减少抗原降解来改善抗原呈递。IPAP还可以极大地延长抗原在注射部位的保留时间，从而增加抗原在引流淋巴结（DLNs）中的暴露。经皮下注射免疫后，IPAP表现出良好的安全性，并展示了其通过DCs增强交叉呈递和后续T细胞交叉激活的能力，强烈激发了体液和细胞免疫反应。凭借多巴胺与多种分子结构共沉积的能力，IPAP适用于引入肿瘤和病毒抗原。鉴于其原位特性，IPAP相较于传统疫苗开发方法具有多重优势，包括消除多步骤制备和复杂的纯化过程。作为概念验证，我们在肿瘤预防和抗病毒疫苗接种的两种临床情景下实施了IPAP，探索其应用潜力。通过使用模型肿瘤抗原OVA，IPAP增强了强效的抗原特异性T细胞反应，抑制了在预防性小鼠模型中OVA过表达的B16-OVA黑色素瘤的发生。用SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基替代OVA，赋予IPAP强烈刺激B细胞反应的能力，在小鼠初次和加强免疫后提升了抗S1 IgG抗体的分泌。IPAP展示了其引发保护性免疫反应的有效性，并为开发不同疫苗以预防肿瘤和传染病提供了独特的途径。
