Science Advances: 细胞起源于雨水稳定下的无膜凝聚态微液滴？
文摘
科学
2024-09-08 10:32
浙江
Did
the exposure of coacervate droplet to rain make them the first stable
protocells?
本周要介绍的文章是美国霍华德·休斯医学研究所Jack W.
Szostak教授与休斯顿大学Alamgir Karim教授的工作。Jack W.
Szostak自1979年开始在哈佛大学医学院任教，是马萨诸塞综合医院遗传学教授，并同时任职于美国霍华德·休斯医学研究所，是2009年诺贝尔生理学或医学奖获得者，其发现了端粒和端粒酶保护染色体的机理。Alamgir Karim教授是休斯顿大学主席教授和材料系主任，对聚合物纳米技术领域有着不同的兴趣和贡献，特别关注薄膜、表面和界面，探索了它们在能源、可持续性和人类健康方面的应用。无膜凝聚体微滴长期以来被提议作为原始细胞模型，因为它们能够通过自然分配方式生长、分裂并浓缩RNA。然而，RNA在这些结构中快速交换，再加上微滴在几分钟内迅速融合，意味着个体微滴无法保持其独立的遗传身份。因此，达尔文进化无法发生，整个群体会因寄生RNA的快速传播而面临崩溃的风险。本研究中发现，蒸馏水模拟雨水或淡水，能够在凝聚体微滴的界面上形成静电交联。这不仅能无限期地抑制微滴的融合，还能根据RNA的长度和结构，在时间和空间上实现RNA的隔离，时间尺度可达数天。这些无法融合的无膜微滴有可能在前生物环境中作为原始细胞发挥作用，并具备演化隔离核酶的能力正文内容：
科学界最令人着迷的问题之一是生命如何在地球上起源。具体而言，非生命物质如何转变为能够执行复制、代谢和进化等复杂功能的活细胞？关于生命起源的一个假说认为，早期地球上的局部前生命环境中包含了许多已知的生命细胞分子构建模块，从而促使了简约的原始细胞结构或原始细胞的自我组装。原始细胞对于生命的出现至关重要，因为它们提供了隔离环境，用于浓缩、组织和复制重要的生物分子，其中最重要的是核糖核酸（RNA）。RNA 被认为是前生物世界和生命起源中的关键分子，因为它兼具储存遗传信息和催化化学反应的功能。根据 RNA 世界假说，RNA 是从较简单的有机分子中出现的第一个生物聚合物，并形成了可以自我复制、进化和多样化的系统。另一个流行的生命起源假说认为，RNA 在原始细胞内的隔离可能是通过两性分子（如脂质或脂肪酸）的囊泡自我组装自然形成的，这些囊泡包裹着一个水核，其中可以进行与代谢和复制相关的关键反应。虽然这些原始细胞与现代细胞相似，但它们缺乏如今高度进化的膜结构，这种膜支持分子运输功能。虽然脂质或脂肪酸膜可以为囊泡提供选择性和渗透性，但只有小分子，如核苷酸及其二聚体或三聚体，才能透过双层膜。随着RNA尺寸的增加，原始细胞需要特定的运输蛋白来促进它们通过细胞膜。在隔离的起源阶段就存在复杂的膜蛋白似乎是极不可能的。一种流行的替代假说认为，原始原始细胞可能来源于无膜凝聚体的形成，即不依赖于脂质膜。这一想法最早由奥帕林在1930年代关于生命起源的开创性研究中提出，其基础源自 Bungenberg de Jong 和 Kruyt 在1929年对凝聚体的描述。凝聚体是通过多种关联相互作用（包括静电和疏水作用）使大分子发生液-液相分离而形成的浓缩液滴。凝聚体微滴无膜，可以通过自然分配摄取这些大分子构建模块，从而使现有液滴持续生长。它们可以通过化学反应引发的形态不稳定性（主动分裂）或剪切作用（被动分裂）反复分裂，并能支持与前生命相关的非酶促RNA复制。凝聚体作为原始细胞的假说相较于膜包围的隔离体有一个关键优势：它们能够通过简单的分配浓缩各种分子，如肽、核苷酸、聚合物、离子表面活性剂和脂肪酸，其中这些分子的运输不受其大小限制，而是由它们对凝聚体基质的亲和力决定。然而，最近的研究表明，这种无膜凝聚体原始细胞的优势特性存在显著缺陷。观察到由于没有膜，RNA分子在凝聚体原始细胞间会迅速交换。RNA的活跃交换会导致所有原始细胞在短时间内具有相同的RNA组合。这一过程将削弱或消除原始细胞在选择压力下的竞争。因此，RNA在凝聚体原始细胞间的快速、不受控制的交换将阻碍基于RNA的生命的进化。除了以上考虑之外，基于凝聚体的无膜原始细胞模型还存在与邻近细胞积极融合的倾向，这同样会促进RNA的交换，并在几小时内导致厚层液体的宏观相分离，最终失去微观隔离结构。对抗凝聚的稳定性对于细胞生命至关重要，因为它使细胞能够在其生命周期内保持个体性和完整性。现代细胞通过存在脂质膜或细胞壁来实现这种稳定性。因此，可以通过在不稳定的复杂液体周围构建膜来抑制凝聚体微滴的融合，从而实现稳定性。需要注意的是，这里所指的“稳定性”实际上是指一种与平衡无关的凝聚抑制的亚稳态。凝聚体微滴已经通过两性分子的界面自组装（如嵌段共聚物、梳形聚合物和磷脂纳米颗粒）实现了对抗凝聚的稳定性。然而，这些特殊分子在前生物时代大量存在的可能性很低，因为它们的结构复杂。此外，膜会阻碍带电大分子（如聚电解质构建模块和RNA）向微滴内的自然分配，并阻止微滴生长。因此，虽然无膜微滴中的RNA快速交换和融合会导致遗传同质化，进而消除任何由于功能更强的核酶突变体带来的选择优势，但稳定膜的存在会阻碍微滴的生长。因此，需要一种前生物上合理的凝聚体稳定机制，既能允许微滴生长，又能防止遗传随机化。在此，我们采用了一种简约设计，实现了无膜凝聚体原始细胞中RNA的隔离，这种细胞在保持抗凝聚稳定性的同时，RNA在邻近原始细胞之间的交换速率呈现出与大小相关的梯度。我们研究了由带正电的聚合物聚二烯基二甲基氯化铵（PDDA）和带四个负电荷的核苷三磷酸腺苷（ATP）形成的凝聚体，这些原始细胞极易发生凝聚。在蒸馏水中对这些凝聚体进行剪切后，我们发现这些原始细胞获得了卓越的界面稳定性，抗融合时间长达数月。我们将这种稳定性归因于液滴界面处的一系列物理化学变化——界面离子浓度的突然不连续，导致界面反离子流失至水相，从而在原始细胞界面上诱发带电大分子之间的静电交联(30)。尽管这些原始细胞没有传统意义上的膜（没有脂质或嵌段共聚物膜），但这些稳定的原始细胞表现出可控的分子货物（蛋白质和RNA）在细胞群体间的交换。我们发现，小的无电荷分子和长度为6至8个核苷酸的较短RNA序列在数分钟的时间尺度内进行交换，而35个核苷酸或更长的RNA序列则保持隔离数天，这可能使催化RNA序列的复制能够在原始细胞间传递，而不会被环境稀释或与其他原始细胞过度交换（nt表示RNA中的核苷酸数）。此外，我们发现即使在较高温度下，这种隔离效应仍然有效，这可能有助于RNA二级结构的部分解链，从而促进前生命引物延伸的发生。总体而言，我们的实验表明，低盐度的淡水（如来自雨水、湖泊以及冰雪融水）可能是RNA在出现复杂膜包围的原始细胞之前，实现简约且稳定隔离的驱动力。凝聚体液滴本质上是不稳定的，并形成“渗漏”的原始细胞通过将PDDA和ATP的水溶液混合，在塑料离心管中制备凝聚体微滴（见图1A的示意图和图S1的结构）。PDDA是一种合成多正离子，而PDDA-ATP是一个被广泛研究的模型体系，本研究的发现也应适用于更符合前生命条件的多正离子体系，如富含赖氨酸或精氨酸结构域的多肽，或像亚精胺和精胺这样低复杂度的多胺。PDDA和ATP按1:1的化学计量电荷比混合，最终浓度分别为20 mM和5 mM（pH = 8.0，mM表示mmol/升）。混合后溶液立即变得浑浊，这是液-液相分离的特征，形成聚合物富集相（凝聚体微滴），悬浮在通常富含排出反离子的聚合物贫相（上清液）中。在上述混合步骤中加入荧光标记的蛋白质分子[牛血清白蛋白(BSA)：CF488-BSA和CF640-BSA]或RNA分子（Cy2标记，长度为6和49 nt；有关使用的RNA序列，请参见表S1）。在pH 7或更高时，BSA和RNA都带负电，因此由于非特异性的电荷-电荷相互作用，优先分配到凝聚体相中。正如预期的那样，这些微滴在抗凝聚性方面不稳定。当含有不同荧光标记货物分子的两种液滴群体混合时，液滴在几分钟内融合，这种融合导致货物的混合，个体液滴的身份丧失（图1B）。此外，光漂白后荧光恢复（FRAP）显示，即使液滴空间上分开以防止融合，荧光标记的RNA仍然在它们之间进行活跃交换，无论RNA的长度如何（图1D和E）。在前生命环境中，RNA的这种快速交换（对于6 nt RNA，τ ≈ 1分钟；对于49
nt RNA，τ ≈ 5分钟）会在极短的时间内（几分钟）导致原始细胞群体间的遗传物质均匀分布，而这种时间尺度与前生命RNA复制、膜包围的原始细胞模型的生长和分裂所需的几小时到几天的时间尺度相比，要短得多。图1.不稳定凝聚态原细胞之间的快速合并和rna交换。为了防止凝聚体模型原始细胞融合，我们将从平衡上清液相中提取的凝聚体宏相（5 μl）转移到蒸馏水（1 ml）中，并进行涡旋混合（图2A）。在之前的一项研究中，我们提出这种处理通过在液滴-水界面形成PDDA和ATP的静电交联层，从而赋予凝聚体悬浮液稳定性（图2B）。当混合含有不同染料标记蛋白货物的稳定原始细胞群体时，它们没有发生融合（图2C和D）。图中不同液滴群体中的BSA货物持续被隔离，也表明这些液滴群体之间没有发生蛋白质货物的交换，因此，这些液滴在储存其货物方面表现出惊人的有效性。长达一个月的时间里，这些液滴不仅抵抗了粗化和宏相分离，还保存了它们的蛋白质货物，因此保持了其身份（图2D）。为了理解所提出的界面交联是否“密封”了液滴界面，从而抑制了大分子跨界面扩散的潜力，我们向稳定的CF640-BSA液滴（宿主）周围的水中加入了少量的CF488-BSA（客体）（图2E）。我们发现液滴界面对这些客体BSA分子高度渗透，它们能够穿过界面扩散并分配到宿主液滴的内部（图2F）。尽管最初这种分配较低，但随着时间的推移，它有所增加。此外，我们发现较小液滴中的分配速度比较大液滴快。这一观察结果可以通过较小液滴的表面积与体积比更高来解释，在这种情况下，跨界面的浓度梯度驱动的客体分子扩散会迅速富集较小的液滴（附注S1）。总体而言，这些观察结果证实了尽管这些稳定液滴的交联界面对分子扩散相当多孔，但已经分配在液滴内部的蛋白质分子仍然保持隔离状态，并且不会扩散出去。接下来，我们探讨这些模型原始细胞在化学变化下的稳定性。
淡水，例如来自雨水或湖泊的水，可能含有微量的溶解反离子（即，每百万分之一的含量）。由于反离子的缺失通过所提出的界面交联机制导致液滴的稳定性，向稳定液滴周围的水中添加盐可能会使其不稳定。我们通过在不同离子强度的NaCl溶液中混合两种荧光不同的液滴群体，测试了这一假设（图3A和附图S2）。在低盐浓度（Cs < 2 mM）下，稳定的液滴仍然保持稳定，没有出现融合迹象。这种盐度远高于淡水源中常见的盐浓度，这表明液滴应在这些淡水源中对融合保持稳定。当盐浓度增加到4 mM时，发现少量液滴发生了融合。而在6 mM的盐浓度下，融合程度突然增加，表明需要达到一定的离子浓度才能打破界面大分子之间的交联，允许融合的发生。这种具有破坏性的盐浓度与不稳定凝聚体悬浮液上清液中的反离子浓度（<12.7 mM；附注S2）处于相同的数量级。类似地，当我们将与不稳定凝聚体液滴平衡的上清液加入到稳定液滴群体混合物周围的水中时，我们发现液滴在体积分数为5%的上清液下保持相对稳定，但在上清液浓度为10%时对融合变得高度不稳定（图3B和附图S3）。尽管DI水中10%的上清液大致相当于1.3
mM NaCl的浓度（附注S2），这一盐浓度在图3A中似乎使液滴相对稳定，但平衡上清液中的PDDA和ATP分子可能也有助于使液滴界面不稳定。由于淡水源可能具有非中性pH值，例如酸性雨水的pH值，我们在pH值范围为4至8的酸性和碱性水中进行了实验，发现将凝聚体转移到这些溶液中制备的液滴没有发生融合（附图S4）。为了进一步验证雨水是否能够使凝聚体液滴在融合中保持稳定，我们收集了雨水并进行了实验。所收集的雨水电导率为3.5 μS/cm，相当于15.7
μM NaCl [尽管雨水中含有许多其他离子，pH值约为6。当将凝聚体转移到此雨水中制备的液滴群体混合时，它们没有融合，并在几天内保持稳定（图3C）。这些实验共同表明，凝聚体液滴可以在低盐淡水（如雨水）中保持稳定，从而提出了一种预生物起源的可能机制，能够阻止基于凝聚体的原始细胞融合。胶体悬浮液通常通过静电和/或位阻排斥来保持稳定（防止聚集或融合）。我们测量了未修饰液滴（即处于其平衡上清液中的液滴）和稳定液滴（即处于去离子水中的液滴）的电位，以估算两种不同环境下液滴表面的电荷，发现DI水中液滴的电位值（+25
mV）低于上清液中的液滴（+44 mV）（附图S5）。为了最小化拥挤悬浮液中的测量误差，我们对悬浮液进行了100倍的稀释并发现其电位值在未修饰液滴为+26 mV，稳定液滴为+25 mV。如果液滴在DI水中的融合被电荷排斥所阻止，那么这种排斥应该也能阻止处于平衡上清液中液滴的融合，因为它们具有类似的电位值。由于液滴在上清液中容易融合，因此可以得出结论，电荷排斥并不是阻止液滴在DI水中融合的主要原因（至少不是唯一原因）。因此，我们推测，液滴的稳定性主要是通过位阻排斥来实现的。相反电荷的多离子彼此吸引，在没有足够浓度的盐/反离子帮助屏蔽其电荷的情况下，这种吸引力会导致固体聚集体（沉淀物）或凝胶的形成。此前研究表明，在不同盐浓度下，聚苯乙烯磺酸（PSS）与PDDA的复合会形成这种现象。我们提出，当凝聚体被转移到DI水中并被剪切时，液滴界面附近的反离子迅速从界面扩散到大体积水中。我们的电导率测量结果证实了这种反离子的排出（附注S2）。反离子的流失会减少对PDDA和ATP上电荷的屏蔽作用，允许这些相反电荷分子的强电荷相互作用（内在离子对）形成。这些强相互作用，我们称之为静电交联，会在液滴表面形成一层薄的弹性膜，从而抑制融合的发生。我们的主要假设是，这种机制源于相反电荷聚合物的快速复合，类似于凝胶化，在这种条件下，自由的、更具流动性的反离子被耗尽。之前研究支持了这一假设，他们观察到，通过透析缓慢提取复合物中的流动反离子，可以从聚电解质中形成强凝胶。为了了解我们的凝聚体液滴是否仅在界面上交联，或者它们是否在整个液滴内部交联，形成贯穿的网络（或凝胶态），我们进行了FRAP测量，以监测标记染料的长链聚电解质在液滴内部的扩散。我们发现，在将凝聚体液滴转移到DI水中后，聚电解质链的扩散性没有显著变化，表明液滴的内部仍保持液态（附图S7）。这一结论得到了此前流变学测量结果的支持，数据显示无论是未修饰液滴还是稳定液滴，其凝聚体相的黏性模量都远高于弹性模量（30）。这一观察结果表明，没有形成贯穿网络，这可能是阻止融合和限制RNA交换的另一种解释，将在后文讨论。上述观察还意味着，液滴转移到DI水后，凝聚体内部应该有足够的盐分来维持液态。定量来看，20 mM PDDA和5 mM ATP会带来20 mM的Na+和Cl−离子，使初始NaCl浓度达到20
mM。我们的电导率测量结果显示，凝聚体形成后的平衡上清液中的NaCl浓度约为12.7
mM。鉴于每毫升溶液形成约11 μl的凝聚体，凝聚体内部的NaCl浓度应至少为670 mM。为了形成稳定的液滴，将5 μl的凝聚体悬浮在1 ml的DI水中，测得DI水中排出的Na+和Cl−离子浓度为0.36 mM。这一测量结果表明，液滴内部的NaCl浓度仍至少为604 mM，即约90%的反离子留在了凝聚体液滴内部。这些观察共同表明，凝聚体液滴在DI水中对融合的稳定性是通过形成一层由PDDA和ATP静电交联构成的薄界面层所实现的。我们认为，这一液滴表皮还控制了大分子进出液滴的流动。利用这些稳定模型原始细胞强大的蛋白质隔离能力，我们制备了含有酶分子的液滴作为货物，以探索它们作为化学功能隔间的能力（图4A）。我们选择了由葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）催化的酶级联反应，其中β-d-葡萄糖分子被GOx氧化，同时生成过氧化氢（H2O2），后者被HRP用于将Amplex Red氧化为荧光活性分子resorufin。因此，可以通过荧光显微镜追踪和量化此反应的进展。我们首先使用稳定方案制备了分别含有CF488-GOx和CF640-HRP的两种不同液滴群体。这些液滴群体与Amplex Red混合后，样品被转移到显微镜的成像腔室中。最后，加入葡萄糖溶液并轻轻混合，开始时间序列成像。成像后立即在HRP液滴中发现了resorufin荧光，表明液滴间发生了分子通信，由基质和产物分子通过半渗透液滴界面的传输和交换所驱动（图4B和附图S8）。由于液滴界面的半渗透性，基质分子（葡萄糖和Amplex Red）能够扩散到液滴内，在相应的酶存在下形成产物，而这些反应产物（过氧化氢和resorufin）在液滴间交换。首先在HRP液滴中观察到resorufin的荧光增加（其产物生成处），然后在GOx液滴中观察到（其从HRP液滴扩散后到达的地方），表明resorufin在凝聚体中有效隔离（低背景荧光），同时在液滴间活跃交换（图4C）。随着时间的推移，这两种液滴群体中的resorufin荧光强度变得相似并达到平台期。这些观察结果表明，尽管基质和产物分子可能由于它们的小尺寸和与凝聚体的低特异性相互作用通过扩散在液滴之间交换，但由于其静电和可能的其他相互作用，酶分子仍然在这些液滴中保持隔离状态。由于稳定的液滴未能与彼此交换其蛋白质货物，我们进一步研究了RNA货物的隔离情况（图5A，RNA序列表S1）。为此，我们将两种稳定的液滴群体以相等体积混合：一种含有6-nt长RNA（Cy2-RNA-6nt）作为货物（RNA液滴），另一种含有CF640-BSA作为货物（BSA液滴）。由于CF640-BSA分子在液滴中能够保持隔离一个月，BSA液滴作为对照用于研究RNA是否会通过扩散驱动的交换现象。在混合后不久（t ≈ 5分钟），我们在共聚焦显微镜下观察到Cy2荧光也出现在BSA液滴中，这表明RNA从其原有液滴扩散到BSA液滴中（图5B）。随着时间的推移，这种转移逐渐增加，从而Cy2荧光在BSA液滴中也随之增加，经过2小时的观察这一现象更为明显（图5B和附图S9）。相比之下，原始RNA液滴中未观察到CF640-BSA的荧光（原始RNA液滴具有高Cy2荧光强度，而在t ≈
0时未观察到CF640荧光），表明BSA分子仍然保持在BSA液滴中隔离，并且该液滴系统对液滴的粗化具有稳定性，因为如果液滴发生融合，将会导致BSA在所有液滴中分布，而这一现象并未观察到。在重复进行相同实验时，我们使用了长度为49 nt的长链RNA（R49或Cy2-RNA-49nt），发现混合后5小时内没有观察到RNA在液滴之间的交换（图5C）。只有在2天后，我们才看到这种长链RNA在液滴之间的显著转移，表明其交换速率非常慢（图5C）。这一观察结果与测试的短RNA寡核苷酸形成了鲜明对比，表明在稳定的液滴中较长的RNA寡核苷酸具有有效的空间和时间隔离。短RNA与长RNA的不同结果表明，RNA在液滴的交联界面上的扩散可能与链长有关。为验证这一假设，我们重复了这些实验，并发现RNA在稳定液滴中的保留确实与其长度有关。混合后立即（t ≈ 5分钟）观察到6 nt、8 nt及较小程度的14 nt RNA存在于BSA液滴中，并且随着时间的推移，这些RNA的浓度在这些液滴中增加（图5D和附图S10）。对这些图像的荧光强度定量分析显示，8 nt RNA的交换明显低于6 nt RNA（附图S9）。此外，长度为24 nt的RNA最初仅出现在自身液滴中，但在2小时内也扩散到BSA液滴中（附图S10）。对于35
nt和49 nt的RNA，我们至少在6小时内未见到有明显的“泄漏”到BSA液滴中，甚至在2天后，交换程度相对较低，与短RNA在分钟到小时之间的交换形成对比（图5D和附图S11）。RNA寡核苷酸的二级结构可能会减少其有效尺寸（相比于随机链的收缩链），进而影响其交换。对于R49，这可能是一个潜在问题，因为它在序列末端包含20个随机核苷酸，这导致形成多个二级结构（表S1、附注S3和附图S12）。为了解RNA的二级结构如何影响其泄漏，我们研究了一种不同的49 nt RNA序列，它折叠成一个特定的结构（称为flexizyme），形成的二级结构小于R49序列（附图S12）。我们发现，flexizyme（Cy2-RNA-49nt-Flexi）的交换速度略快于R49。在最初的5小时内，我们没有看到Cy2标记的flexizyme在液滴间的显著交换，这与R49的结果类似（附图S13）。只有在2天后，flexizyme才在大多数BSA液滴中出现，这与R49形成了鲜明对比。较长RNA寡核苷酸在稳定液滴之间的受限交换可能是由于以下变化：稳定过程中共聚物基质的粘度增加导致RNA寡核苷酸扩散缓慢，或者由于提议的界面交联的出现形成了物理屏障，限制了RNA在液滴界面上的扩散，或者两者的结合。先前对液滴内多电解质链扩散系数的测量表明，稳定过程中液滴的粘度变化不大。此外，当我们尝试通过FRAP测量RNA寡核苷酸在不稳定和稳定液滴中的扩散系数时，由于RNA寡核苷酸的扩散速率非常快，我们无法获得可靠的光漂白图像。RNA寡核苷酸的扩散速率可能超过了相机的捕捉时间（每帧0.2秒，直径为10μm的液滴中直径为3μm的圆形漂白区域）。因此，液滴中的共聚物基质导致RNA扩散减缓的可能性较小。为了了解界面上的物理屏障是否限制了RNA寡核苷酸的交换，我们通过将稳定液滴引入稀释的Cy2标记RNA溶液中，并跟踪RNA在液滴中的强度变化来研究RNA的扩散速率（图5E）。长度为6 nt的短RNA寡核苷酸在混合后立即出现在BSA液滴中，尽管在不同液滴中浓度略有不同，这从液滴的荧光强度差异中可以看出（图5F）。随着时间的推移，这种浓度增加并在液滴中变得均匀。相比之下，49 nt长RNA寡核苷酸的吸收速度要慢得多，最初液滴中的RNA含量非常低（图5G）。这种含量逐渐增加，尽管小液滴在3小时后浓缩了大量RNA，但在一些较大的液滴中仍几乎没有存在。与之前相同，RNA的扩散控制运输在液滴中的浓度与液滴的大小呈反比（图5H和附注S1）。在稳定液滴中，6 nt RNA（少于5分钟）与49 nt RNA（超过3小时）的摄取时间差异远大于未改性液滴中的时间差异（图1，D和E）。因此，RNA链通过稳定液滴界面的扩散受到界面交联层的孔隙度控制。这些孔隙限制了长RNA寡核苷酸在液滴界面上的扩散，同时允许短RNA的运输。有效隔离液滴内RNA的临界大小因此依赖于交联界面的孔隙度。不同的分子参数，如聚电解质链长度和核苷酸大小，以及系统参数，如pH、离子强度和反离子价态，预计会影响孔径的大小。温度和热梯度在原始世界的演化和动态中被认为发挥了关键作用，例如，通过影响必需有机分子的可用性和反应性。热梯度或波动也可能通过帮助短链双链的变性（链分离）影响RNA化学。因此，了解液滴在适度升高温度下的稳定性非常重要。我们将混合的RNA和BSA液滴加热到40°C，观察这种升高的温度下是否有RNA或BSA交换的迹象。加热并未引起Cy2-RNA-35nt或Cy2-RNA-49nt与周围BSA液滴的交换，隔离性在2小时后仍然保持（附图S14）。在将相同样品再次加热到50°C 2小时后，我们确实看到35 nt RNA在液滴之间有轻微交换（图6A）。对于更长的49
nt RNA，这种交换几乎不存在（图6B）。因此，这些稳定的液滴在升高温度下仍能保持RNA寡核苷酸的隔离，可能在非平衡热循环期间促进寡核苷酸的复制化学。稳定的凝聚态液滴是否能作为原始原生细胞在生命起源过程中发挥作用？发现凝聚态液滴可以通过将其转移到蒸馏水中来稳定，重新激活了这样一个可能性，即生命可能是在通过带电聚合物的相分离自发形成的隔间中出现的。我们使用的稳定技术只需将凝聚态液滴暴露于蒸馏水中，即可形成稳定的界面交联。雨水本质上是蒸馏水，几乎不含离子，并且在原始地球上很常见，这表明凝聚态液滴可能通过降雨或在低盐淡水环境中的运输而得到稳定。我们认为，达尔文进化可能发生在这些凝聚态液滴原生细胞中，其中长RNA寡核苷酸的隔间化由于液滴融合的缺失和RNA在液滴之间的交换受限而得以维持。尽管长寡核苷酸的有效时空隔间化是达尔文进化的前提条件，但短寡核苷酸（<10 nt）的快速交换可能有利，例如，通过提供RNA复制的原料，或有害，例如，通过非特异性相互作用干扰RNA复制。在我们检查的稳定凝聚态液滴中，RNA的交换取决于链长（短与长）和形状（随机卷曲与二级结构）。为了长期维持个别液滴的遗传身份，可能需要进一步减少RNA交换。我们建议，这可能通过使用具有强或弱电荷功能团的不同聚电解质来调节界面交联的程度来实现。RNA在凝聚态液滴中的扩散速率以及液滴之间RNA交换速率的差异可能允许使用扩散受限的反应路径形成复杂的多液滴系统。或者，在多相凝聚态中形成内部子隔间，其中两个或更多不可混合的无膜凝聚态以分层形态共存，可能允许反应化学的时空组织。当我们使用由另一种聚负离子——羧甲基右旋糖苷（CMD）与PDDA形成的凝聚态时，我们确实看到在稳定的PDDA-CMD凝聚态液滴中形成RNA隔间，这表明使用不同的聚电解质系统可以进一步阐述层级复杂性。我们研究的酶级联反应被选择来展示原生细胞之间化学通信的潜力。原则上，化学通信也可以通过与生命起源相关的RNA化学介导。例如，原生细胞可以使用自剪接RNA或由核糖体酶辅助的底物裂解反应，通过将短RNA链作为其裂解产物在短时间内传送给相邻的原生细胞。交换的较短链可以调节接收原生细胞的核糖体酶活性或参与连接化学。在核糖体酶化学的背景下，值得注意的是，这些反应需要Mg²⁺离子以发挥核糖体酶的功能，并且许多研究表明Mg²⁺离子优先分配到凝聚态相中。稳定的原生细胞自发地从周围水中招募寡核苷酸和肽的能力可能允许液滴生长。虽然我们尚未研究稳定的凝聚态液滴的生长和分裂，但我们预计它们会在添加构建块（聚电解质和核苷酸）后生长，因为我们已经证明了这些带电大分子的摄取。此外，尽管界面交联可能表明液滴会抵抗剪切驱动的裂解，但界面确实会变形以应对外部压力。之前的研究表明，这种变形可能允许液滴分裂，尽管可能需要比未修改液滴更高的剪切速率。显然，稳定的凝聚态液滴是否能经历生长和分裂的周期还需要进一步研究。在原始地球上，能够生长和分裂的无膜隔间，并且具有适当的内部RNA化学以允许RNA复制，可能会传播和进化。总的来说，我们介绍的稳定凝聚态原生细胞解决了凝聚态作为原生细胞面临的两个主要挑战：融合和交换。因此，这种原生细胞模型为生命起源研究开辟了可能性，并提出了许多令人兴奋的问题，例如：如何通过选择凝聚态聚电解质来操控交换的大小选择性？二价离子的存在如何影响液滴的稳定性，并且它们的分配如何受到稳定化过程的影响？环境条件如盐度和降雨的变化如何影响RNA交换，从而影响整体进化过程？对RNA化学的未来研究，例如在稳定的凝聚态原生细胞内进行非酶促引物延伸，可能会更详细地阐明这些现象。方法：
材料
PDDA（8.5 kDa）购自Polysciences。二钠ATP、NaCl、NaOH、HCl（2 mol/L）、d-(+)-葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，360 kDa）购自TCI Chemicals。反应性荧光染料[N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯功能化的CF488A和CF640R]及荧光标记的BSA（CF488A标记：CF488-BSA和CF640R标记：CF640-BSA）购自Biotium。GOx（G2133）、HRP（P8375）、醋酸铵、EDTA、甲酰胺和异丙醇购自MilliporeSigma。Amplex red（A12222）、二甲基亚砜（DMSO）和三乙胺三氢氟化物（TEA; 3HF）购自Thermo Fisher Scientific。除非另有说明，否则所有试剂未经进一步纯化直接使用。蒸馏水（DI水，18兆欧厘米）由MilliporeSigma的Milli-Q系统制备。寡核苷酸合成
Cy2标记的RNA寡核苷酸（序列见表S1）在实验室使用K&A H-6 DNA/RNA合成仪合成。试剂和磷酰胺化合物购自ChemGenes（马萨诸塞州威尔明顿）和Glen Research（弗吉尼亚州斯特林）。合成后，RNA通过加入1.5 ml体积比为1:1的28%水性氨溶液和40%水性甲胺溶液，在室温下孵育15分钟，从固体载体中裂解。裂解后，核碱基在相同溶液中于65°C下脱保护15分钟。短暂冷却后，在真空离心浓缩器中蒸发2小时，并冻干16小时。通过将冻干的RNA溶解于100 μl无水DMSO和125
μl TEA.3HF中，并在65°C下加热2.5小时，去除2′-O-TBMDS保护基团。完全脱保护的RNA用22.5 μl 5 mol/L的醋酸铵和1
ml异丙醇稀释，并在干冰上沉淀20分钟。沉淀的RNA用80%乙醇洗涤后，溶解于99%甲酰胺中的5 mM EDTA溶液中，并通过变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。剪下目标RNA条带后，将其压碎并在5 mM醋酸钠（pH 5.5）和2
mM EDTA（pH 8.0）（总未调整pH=7.0）的溶液中浸泡16小时。通过5 μm针头过滤器滤掉凝胶碎片后，使用Waters（马萨诸塞州米尔福德）的C18 Sep-Pak柱脱盐RNA。酶的染料标记
蛋白标记使用氨基反应性荧光染料共价连接标签。冻干的酶（2 mg，GOx或HRP）溶解于1
ml碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）中。在该混合物中，NHS酯功能化荧光染料以1:1的化学计量比加入（GOx加入1.25 μl NHS-CF488A，HRP加入5
μl NHS-CF640R），来自DMSO中的10
mM储备液。混合物在室温下避光2小时，使反应发生。反应后，将混合物转移至10 kDa分子量截断的超速离心过滤管中，并以12,000g离心，直至溶液减至50 μl。未反应的染料通过过滤器排出，而染料结合的酶保留在管中。标记部分用缓冲液清洗两次，再用DI水洗一次，以确保完全去除未反应的染料。标记的酶用DI水补至1 ml，确保初始浓度为2 mg/ml。储备液在4°C下保存。凝聚态液滴的制备及在DI水中的稳定化
通过向DI水中加入ATP储备溶液，然后加入PDDA，制备凝聚态液滴，最终浓度为20 mM PDDA（以单体计，20
mM正电荷）和5 mM ATP（20
mM负电荷）。已知电荷平衡条件允许最大量的凝聚态液滴从相分离中产生。最终溶液的pH值用NaOH调节至8.0，以确保ATP完全去质子化。为了制备带有货物的凝聚态液滴，在加入PDDA之前，加入染料标记的BSA（或RNA、GOx和HRP）分子，最终浓度为10 nM。1 ml的聚电解质混合物产生约11 μl的凝聚态宏相，这表明凝聚态中染料标记分子的最终浓度大约为1 μM。为了制备液滴混合物，将来自两个样品的凝聚态液滴悬浮液等体积移入小瓶中，用涡旋振荡器混合30秒，然后转移至96孔板中进行成像。为了制备稳定的原生细胞，将凝聚态宏相通过离心1,000g离心5分钟收集，然后移取5 μl宏相，重新悬浮于1 ml DI水中。为了制备稳定的凝聚态液滴混合物，将两个样品的液滴-水悬浮液等体积移入小瓶中，涡旋混合30秒后转移至96孔板中进行成像。在所有实验中，使用涡旋混合器进行混合，样品在混合后不久移取，以避免因沉降引起的液滴浓度变化。
