编辑 | 小杨
撰文 | 小杨
文献信息：
Phase-separating peptides for direct cytosolic delivery and redox-activated release of macromolecular therapeutics
Nat. Chem.
本周要介绍的文章来自于新加坡南洋理工大学Ali Miserez课题组，Ali Miserez 是NTU材料科学与工程学院和生物科学学院教授。Miserez 博士的研究重点是揭示独特生物材料的分子、物理化学和结构原理，并将这些设计转化为新颖的仿生合成策略。他的研究小组具有很强的跨学科性，分子生物学家、化学家、生物物理学家和材料科学家将他们的专业知识从各个角度结合到生物启发工程，包括蛋白质生物化学、细胞外组织转录组学、聚合物化学、仿生肽设计、生物物理学和纳米力学。
生物大分子作为治疗多种疾病的治疗手段具有巨大的潜力。然而，由于细胞膜通透性差，限制了它们对细胞内靶点的访问。为了克服这一挑战，通常采用纳米级载体，但这些载体容易被困在内体腔中。在此报道了一种由pH和氧化还原响应的共组凝聚物微滴形成的缀合肽，这些微滴通过液-液相分离形成，并能够轻松穿过细胞膜。各种大分子可以迅速被这些微滴捕获，包括小肽、分子量高达430 kDa的酶和信使RNA（mRNA）。这些携带治疗物质的共组凝聚物绕过经典的内吞途径进入细胞质，并在细胞内通过谷胱甘肽介导的方式释放其负载物，保持生物活性。同时，mRNA展示了高效的转染效率。这些肽类共组凝聚物为细胞内递送各种大分子治疗物质提供了一个极具前景的平台，既有潜力用于治疗多种病理（如癌症和代谢疾病），也可作为mRNA疫苗的载体。
正文内容：
生物大分子，包括肽类、蛋白质和RNA，作为治疗多种疾病的有前景的治疗手段，具有高效力、特异性和安全性等优势。然而，由于这些生物大分子的细胞膜通透性差和/或容易被内体困住，导致其在细胞内的暴露有限，其治疗潜力尚未完全实现。因此，开发能够安全递送治疗载荷到细胞质的载体成为广泛研究的热点。理想情况下，载体能够通过化学编码实现内体逃逸，从而促进治疗载荷的释放。此外，使用非内吞机制进行递送也是提高递送效率的另一种方式。同样重要的是，封装方法不能影响载荷的生物活性，并且载体应表现出极低的细胞毒性。
目前，解决这些问题的策略主要依赖于纳米级载体，如无机纳米粒子、合成聚合物或能够介导细胞膜融合的纳米级混合组装体。在其他方法中，生物大分子药物通常与细胞穿透肽缀合或复合，以增强内体逃逸能力。尽管这些方法具有临床转化的前景，但也存在一些缺陷。特别是，制备方法复杂，常用有机溶剂可能降低载荷的生物活性。一些载体仅适用于特定类型的生物大分子，另一些则限制于释放相对低分子量的载荷。此外，对于一些载体（如无机和脂质纳米粒子）还存在安全性问题。无论载体是无机的还是有机的（聚合物、脂质、肽类或它们的融合物），通常认为其尺寸必须小于约200 nm才能穿过细胞膜。然而，我们实验室最近的研究挑战了这一观点。我们发现，通过液-液相分离（LLPS）获得的微米级肽类共组凝聚物能够通过非内吞途径穿过细胞膜，这为治疗药物的细胞内递送提供了新的可能性。受自凝聚的富含组氨酸的喙蛋白（HBPs）的启发，这些肽类共组凝聚物相较于传统纳米级载体具有以下几个优势：1）能够在几秒钟内快速且高效地捕获治疗载荷；2）生物活性保护的水相条件；3）肽类构件的细胞毒性可忽略不计。此外，通过单个氨基酸突变，可以精确调控诱导凝聚的理化条件。
基于这些优势，我们推测肽类共组凝聚物可以用于递送广泛的大分子治疗药物，其分子量和等电点（IEP）范围广泛。为此，我们开发了短的富含组氨酸的pH响应性喙肽（HBpep）共组凝聚物，这些凝聚物与含二硫键的自毁性基团缀合，触发微滴的解体，促进在细胞内还原环境中的载荷释放。我们的研究表明，这些共组凝聚物微滴能够绕过经典的内吞途径，直接且高效地将从726 Da的小型治疗肽到430 kDa的大型酶等各种大分子递送到细胞质中。此外，它们还能高效递送信使RNA（mRNA），并防止其被核糖核酸酶（RNase）提前降解。总的来说，这些稳健的缀合肽共组凝聚物可以作为一种广泛的大分子治疗药物的细胞内递送平台。
氧化还原响应性肽类共组凝聚物的制备和表征
作为初步的自凝聚肽，我们选择了富含组氨酸的喙肽（HBpep），其优点包括生物来源、高效招募客户分子（效率超过95%）和低毒性。值得注意的是，HBpep共组凝聚物可以通过无内吞途径穿过细胞膜，表明其在细胞内递送治疗物质方面的潜力。HBpep具有低序列复杂性，由五个重复序列GHGXY（X可以是亮氨酸（L）、脯氨酸（P）或缬氨酸（V））组成，末端有一个色氨酸（W）残基，这为进一步调节其相分离行为提供了可能。HBpep的一个关键特征是其含有的五个组氨酸残基，赋予其pH响应的液-液相分离（LLPS）行为。具体来说，HBpep在低pH条件下呈现单体状态，但在中性pH条件下迅速相分离形成共组凝聚微滴，同时从溶液中招募各种大分子。
在初步尝试中，使用HBpep共组凝聚物招募和递送增强型绿色荧光蛋白（EGFP）取得了成功，且在多种细胞系中实现了细胞摄取。然而，含有EGFP的微滴在细胞内形成了类细胞器的结构，并且在HepG2细胞中至少稳定了三天，在T22细胞系中则稳定了长达七天，但未释放其载荷。
图1: Design of redox-responsive peptide coacervates HBpep-SR with direct cytosolic entry that bypasses classical endocytosis.
通过单个氨基酸水平的操控，HBpep的相分离pH值发生了显著变化。具体来说，在第16位插入一个赖氨酸（Lys）残基（HBpep-K）使相分离的pH从约7.5上调至9.0。接下来，一个含二硫键的基团被连接到插入的赖氨酸残基的氨基上，以中和额外的正电荷并增加肽的疏水性。这个连接的基团具有自损性，通过一系列的自催化反应最终恢复赖氨酸残基的氨基，反应从二硫键的还原开始，接着进行一系列侧链重排反应。经过修饰后，带有乙酰基（HBpep-SA）和苯基（HBpep-SP）基团的肽在pH 6.5下能够相分离，形成稳定的微滴。这种设计允许修饰后的肽（HBpep-SA和HBpep-SP，统称为HBpep-SR）在pH 6.5下形成直径约为1微米且分布相对狭窄的共组凝聚微滴。
关键是，HBpep-SR肽能够在自凝聚过程中招募广泛的大分子，包括蛋白质、小肽和mRNA，且它们的尺寸和zeta电位没有显著变化。这些载有货物的共组凝聚物在近生理和血清条件下保持稳定，直到被细胞内吞。由于侧链基团的自损性，细胞质中丰富的还原剂如谷胱甘肽（GSH）可以触发还原反应，进而切断修饰的侧链，将HBpep-SR转变为HBpep-K。通过高效液相色谱（HPLC）和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）验证，在含GSH的条件下24小时，大部分HBpep-SP共组凝聚物被还原，生成含硫醇的中间体，最终转化为HBpep-K。由于HBpep-K在中性pH下会恢复为单相（即溶液中的单体肽），我们推测，GSH触发的还原反应会导致细胞质中共组凝聚微滴的解组，从而释放载荷。因此，如图1所示，通过结合肽的pH和氧化还原响应性，有可能设计出细胞内递送平台。值得注意的是，简单地对HBpep-SR侧链末端的修饰（HBpep-SA与HBpep-SP的比较）导致了肽还原速率的显著差异。HBpep-SA和HBpep-SP在早期阶段（2-10小时）的浓度衰减可以很好地符合一级反应模型，且HBpep-SP的反应速率约为HBpep-SA的两倍，因此有可能通过这种方式调节治疗物质释放的动力学。
图2：Characterization of modified HBpepcoacervates
and intracellular delivery of EGFP.
通过氧化还原响应性共组凝聚体介导的EGFP模型蛋白递送
为了评估我们设计的肽共组凝聚体的细胞内递送效率，首先将EGFP作为模型蛋白引入到HBpep-SA和HBpep-SP共组凝聚体中，然后将其与细胞孵育。如图2d-g所示，EGFP负载的共组凝聚体在4小时内被肝癌细胞（HepG2）内化，并在24小时内释放到细胞质中。作为对照，我们验证了EGFP单独无法跨越细胞膜的事实。此外，研究发现HBpep-SP比HBpep-SA具有更快的释放速度，并在4小时后开始释放其EGFP货物，这与图2c和补充图4中显示的HBpep-SP的更快还原率一致。这进一步表明，通过对连接基团侧链的微小修饰，可以控制载荷释放的动力学。
为了进一步研究这一递送系统的多样性，我们在另一种癌细胞系（A549）以及两种健康细胞系（NIH 3T3和HEK293）中测试了EGFP负载的HBpep-SP共组凝聚体。根据细胞内观察到的荧光信号（图2h-j），验证了HBpep-SP共组凝聚体的细胞内递送和释放能力。值得强调的是，未修饰的HBpep（即没有添加赖氨酸残基且未连接自损基团）在细胞质中仍保持为球状点结构，持续三天到一周，但并未释放其载荷（补充图1-3和补充视频1和2），表明共组凝聚体的解组和释放是由自损基团的氧化还原特性激活的。
为了进一步验证这一机制，我们在含或不含GSH的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4，离子强度为0.15 M）中测量了HBpep-SP共组凝聚体释放EGFP的情况。如扩展数据图4a所示，在没有GSH的PBS中，EGFP的释放可以忽略不计，但在含有1 mM GSH的PBS中，24小时后释放量达到约90%。此外，在0.1 mM的中间浓度下，释放情况可在这两种状态之间调节。值得注意的是，在这三组样品中，GSH浓度是唯一的变量。我们还在预先用GSH耗尽剂l-丁硫氨酸-亚砜胺（BSO）处理的HepG2细胞中进行了细胞摄取实验。与正常HepG2细胞中均匀释放EGFP相比（扩展数据图1b），GSH耗尽的细胞中仅含有少量的荧光点，表明在这种情况下EGFP未在细胞质中释放（扩展数据图1c）。这些数据表明，共组凝聚体的解组和治疗物质的释放是由GSH激活的。
扩展数据图1：EGFP release from HBpep-SP coacervates triggered by GSH.
HBpep-SP共组凝聚体递送和释放不同分子量和等电点（IEPs）的蛋白质
在成功递送和释放EGFP后，我们决定进一步检查使用HBpep-SP共组凝聚体是否也可以将具有不同分子量和IEPs范围的蛋白质递送到HepG2细胞中。首先评估了溶菌酶和牛血清白蛋白（BSA），这两种常见蛋白质具有显著不同的分子量和等电点。如图3a,b所示，标记了Alexa
Fluor 488（AF）的溶菌酶和BSA都能递送到HepG2细胞中，并在24小时内释放到细胞质中。另一方面，未被共组凝聚体招募的自由态蛋白质无法被细胞内化（补充图5b,c）。
图3: Intracellular protein delivery into HepG2 cells.
为了进一步确认我们的肽共组凝聚体递送系统的多功能性，我们选择了β-半乳糖苷酶（β-Gal），这是一种分子量非常高的酶（分子量430 kDa），由于其高分子量，很难与常规纳米载体形成复合物，因此细胞内递送具有挑战性。我们的系统克服了这些障碍，因为几乎所有处理了β-Gal负载的HBpep-SP共组凝聚体的HepG2细胞都因β-Gal催化水解5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷（X-Gal）而变蓝（图3e）。相比之下，单独处理β-Gal的细胞中未形成蓝色色素（图3f），进一步证实了HBpep-SP共组凝聚体能够递送大型酶并保持其生物活性。
我们还将荧光EGFP和R-PE负载的HBpep-SP共组凝聚体在HepG2细胞中的递送效率与商业蛋白转染试剂（包括Pro-Ject和Xfect）进行了比较。对于这两种蛋白质，HBpep-SP表现出比Pro-Ject和Xfect更好的性能（图4a-c,e-g），细胞内的荧光信号更强且更均匀。通过荧光激活细胞分选（FACS）分析进一步定量（图4d,h），HBpep-SP在EGFP（99.3%）和R-PE（98.8%）递送中的极高效率得到了证实，远远超过了Pro-Ject（EGFP，65.9%；R-PE，33.3%）和Xfect（EGFP，49.4%；R-PE，71.0%）。除了其稳定性和高递送效率外，我们的共组凝聚体系统还受益于水基制备方法和操作简便性，相比之下，Pro-Ject等脂质基递送试剂在样品制备中需要使用有机溶剂。
图3: Comparison of intracellular protein delivery into HepG2 cells mediated by HBpep-SP coacervates with commercial reagents used for protein delivery.
综上所述，这些结果表明，HBpep-SR共组凝聚体能够高效招募（扩展数据图6）并直接递送具有不同分子量和等电点的蛋白质进入细胞质（图3g），递送率非常高，并且其载荷招募过程完全在水环境中进行，操作简便且快速。这些特点使得HBpep-SR共组凝聚体能够在不进行额外化学修饰的情况下，招募天然和工程化蛋白质，并保持其生物活性，使其成为单一和多蛋白质疗法的有前景和灵活的平台。
由HBpep-SP共组凝聚体介导的肽类递送
与基于蛋白质的治疗相比，肽类显示出特定优势，如低免疫反应和可扩展性。因此，我们选择了两个短肽，包括第二线粒体衍生激活因子（Smac，AVPIAQK）和促凋亡结构域（PAD，KLAKLAKKLAKLAK）肽，通过HBpep-SP共组凝聚体递送至HepG2细胞。值得注意的是，这两种肽在HPpep-SP共组凝聚体中的招募效率均超过90%（扩展数据图3）。
扩展数据图3: Recruitment efficiency of biomacromolecules by HBpep-SP coacervates (1 mg/mL).
此前研究表明，这两种肽通过促进胱天蛋白酶活性或引发线粒体膜破裂具有抗癌作用。如图5a所示，使用FITC标记的Smac肽负载的共组凝聚体处理的HepG2细胞内检测到了强烈的荧光信号。相比之下，FITC标记的Smac单独并不能穿过细胞膜（图5b）。FITC标记的PAD肽递送也显示了类似的结果（图5d,e）。此外，Smac和PAD负载的HBpep-SP共组凝聚体的抗癌活性如图5c,f所示。处理了Smac和PAD负载共组凝聚体的HepG2细胞显示分别28%和33%的细胞死亡率（肽浓度为10 μg ml−1）。相比之下，单独处理Smac或PAD肽的细胞几乎没有细胞毒性，而未负载治疗肽的HBpep-SR共组凝聚体也没有显示出细胞毒性。
图5: Intracellular peptide delivery into HepG2 and HCT116 p53+/+ cells.
我们接着探讨了HBpep-SP是否能够介导与MDM2和MDM4结合的抗癌肽的递送，这两者是抑制肿瘤抑制蛋白p53的关键负性调节因子，但这些肽通常具有有限的细胞渗透性。测试的肽包括线性D-氨基酸肽（dPMI-δ）38、携带α-螺旋诱导残基Aib的线性肽（MP-189）39以及由于其多阴离子特性而被设计为不可渗透的化学钉住肽（MP-950）40。作为对照，我们还包括了一种具有验证的细胞渗透性的钉住肽MP-08139,40（肽序列见补充表2）。通过竞争性拮抗剂抑制MDM2/4会导致p53水平升高，并增加p53依赖基因（如p21）的转录41。在所有情况下，HBpep-SP增强了这些肽的递送和细胞内活性，表现为HCT116 p53+/+大肠癌细胞中p53和p21水平的升高（图5g和补充图6）。这对于高亲和力肽MP-081（Kd = 14.1 ± 7.3 nM）和MP-950（Kd = 2.3 ± 0.8 nM）40尤为显著，这两种钉住肽显示出与细胞可渗透的小分子MDM2抑制剂Nutlin-3a42相似的细胞内活性。这一表型在其非结合对照肽（MP-202和MP-400）中未观察到。HBpep-SP共组凝聚体未破坏细胞膜完整性（通过乳酸脱氢酶（LDH）释放测量，图5h和补充图6），排除了由于膜毒性引起的非特异性p53激活。需要强调的是，MP-081是被设计为具有内在细胞渗透性的39,40（见图5g中的第8条和第13条未处理对照的比较）。然而，当MP-081通过HBpep-SP共组凝聚体递送时，其细胞渗透性进一步增强：比较第8条（单独的MP-081）和第9条（通过HBpep-SP共组凝聚体递送的MP-081）。总体而言，数据表明HBpep-SP共组凝聚体能够安全地递送和释放一系列治疗肽，并保持其活性。
我们还使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM；扩展数据图4）观察了标记肽和蛋白质在细胞内的分布。较大分子量的R-PE蛋白主要出现在细胞质中，而较小的EGFP和FITC标记的Smac肽则在细胞核内检测到，表明核膜渗透性可能与载荷的大小有关。另一方面，HBpep-SP似乎无法促进核膜的转移，可能是因为共组凝聚体已在细胞质中解体。
扩展数据图4: Confocal images of HepG2 cells treated with cargo-loaded HBpep-SP coacervates.
由HBpep-SP共组凝聚体介导的mRNA递送
基因治疗一直被认为是一种治疗癌症、遗传疾病和传染病的潜在方法43。在这些疾病中，基于mRNA的疗法最近因其生物安全性和大规模生产能力而引起了越来越多的关注44,45。其最成功且戏剧性的一次应用是，mRNA技术被用于开发首批批准的新冠疫苗5,6。这些进展表明合成mRNA确实可以进入人体细胞，并产生多个目标蛋白副本，从而为治疗人类病理开辟了广阔的可能性。然而，当前mRNA递送载体——脂质纳米颗粒——存在一系列缺点，包括毒性和有限的组织分布。因此，我们评估了我们的氧化还原响应型共组凝聚体微滴是否也可以用于递送mRNA。我们使用编码荧光素酶报告蛋白的mRNA对HBpep-SP的转染效率进行了评估，并将其与常用的mRNA转染试剂（聚乙烯亚胺（PEI）和Lipofectamine 2000及3000）进行了比较。在最佳肽浓度下，HBpep-SA和HBpep-SP共组凝聚体的转染效率高于PEI和Lipofectamine 3000，但在HepG2细胞中略低于Lipofectamine 2000（图6a）。此外，在HEK293细胞中，HBpep-SP共组凝聚体的转染效率与Lipofectamine 2000相当（图6d）。重要的是，在最佳浓度下，HBpep-SA和HBpep-SP共组凝聚体均未表现出细胞毒性（扩展数据图5）。
扩展数据图5: Cytotoxicity of empty redox-responsive HBpep-SR coacervates.
图6: Intracellular mRNA transfection.
在成功递送了编码荧光素酶的mRNA后，进一步研究了HBpep-SP共组凝聚体在递送编码EGFP（绿色荧光蛋白）的mRNA（Cy5标记）时的转染效率。根据图6b和图6e中展示的荧光显微照片，绝大多数HepG2和HEK293细胞成功转染了mRNA，因为大多数细胞表现出强烈的绿色荧光。通过FACS分析，我们确定编码EGFP的mRNA在HepG2细胞中的吸收效率达到了~98%（图6c及补充图7a）。此外，72%的HepG2细胞在24小时后表达了EGFP。在HEK293细胞中，94.8%的细胞展示了共组凝聚体的内化，81.6%的细胞在24小时后表达了EGFP（图6f及补充图7b）。如此高的mRNA转染效率表明，我们的氧化还原响应型HBpep-SP共组凝聚体可能代表了一种高效的基因治疗载体。例如，我们设想该平台在原理上也可用于递送其他核酸，如质粒DNA、微小RNA和小干扰RNA。结合其蛋白质递送能力及对生物大分子高效的招募效率（扩展数据图6），HBpep-SP共组凝聚体还可作为递送蛋白质/核酸复合物的工具，这是基因组编辑系统（如CRISPR/Cas9）中的关键步骤46。
mRNA治疗的一项局限性在于其不稳定性和易被RNase快速降解47。因此，我们评估了HBpep-SP共组凝聚体是否能够提高mRNA的稳定性。我们将加载mRNA的共组凝聚体暴露于高浓度（1 mg ml−1）的RNase A中2小时后，进行了电泳实验（扩展数据图6），结果显示在共组凝聚体中招募的mRNA分子量保持不变。相比之下，游离的mRNA在凝胶中已无法检测到，表明其被快速降解。这些数据表明HBpep-SP共组凝聚体能够保护mRNA免受早期降解。
扩展数据图6: Gel electrophoresis of mRNAs showing protection from RNase A enzyme for mRNA recruited in HBpep-SP coacervates.
HBpep-SP共组凝聚体的内化机制研究
HBpep-SP共组凝聚体的尺寸约为1 μm（扩展数据图7），显著大于典型的纳米载体，且具有液态特性。因此，共组凝聚体显示出如此高的细胞吸收效率，这表明其内化途径与常规的内吞作用不同。
扩展数据图7: Characterization of pristine and biomacromolecules-loaded HBpep-SP coacervates.
为了确定HBpep-SP共组凝聚体是否被困在内涵体内，我们使用LysoTracker染料对溶酶体等酸性细胞器进行染色。基于共聚焦显微镜图像（图7a及扩展数据图10），EGFP和AF-BSA负载的HBpep-SP共组凝聚体未显示与溶酶体的共定位，且保持了较高的荧光强度。由于EGFP的荧光在低pH下会被猝灭，如果微滴被困在溶酶体的酸性pH环境中，则不会观察到荧光信号。这进一步支持了这些微滴并未被困在溶酶体中，尽管它们可能存在于早期内涵体中。
图7: Cell internalization mechanism study of coacervates.
随后，我们用内吞抑制剂处理细胞，包括氯丙嗪（CPM，抑制网格蛋白介导的内吞作用）、阿米洛利（AM，抑制胞饮作用）和叠氮化钠（NaN3，抑制能量依赖的内吞作用）。结果显示，这些抑制剂均未影响EGFP负载的HBpep-SP共组凝聚体的摄取（图7b,c）。然而，经过甲基-β-环糊精（MβCD）预处理的细胞几乎没有摄取HBpep-SP共组凝聚体。MβCD的作用是耗竭细胞膜中的胆固醇，显然阻止了HBpep-SP共组凝聚体的内化，提示其摄取机制依赖于胆固醇介导的脂筏。这些结果表明，HBpep-SP共组凝聚体的摄取机制并不遵循经典的内吞途径，尤其不是网格蛋白介导的内吞作用——细胞摄取最常见的内吞途径。相反，细胞的摄取似乎是通过脂筏介导的内吞作用完成的。需要强调的是，叠氮化钠（NaN3）并未阻止共组凝聚体的摄取，NaN3会抑制所有能量依赖的路径，这表明HBpep-SP共组凝聚体的摄取可能是一种依赖膜流动性的被动摄取机制，因为胆固醇耗竭（通过MβCD）和低温处理（图7b,c）——这两者都被证明会影响膜流动性——均抑制了共组凝聚体的摄取。
扩展数据图8: Confocal microscopy images of HepG2 cells treated with AF-BSA loaded HBpep-SP coacervates (green) for 2 hours.
尽管关于具体的摄取机制仍有一些未解之谜，但这些结果表明HBpep-SP共组凝聚体避免了内涵体逃逸，直接将生物大分子货物递送并释放至细胞质中，同时保持了其生物活性。
结论：
我们已经证明，HBpep-K与自我解聚基团（HBpep-SR）结合，表现出液-液相分离（LLPS），形成共组凝聚微液滴，能够高效招募各种生物大分子（包括蛋白质、肽和mRNA）。负载货物的共组凝聚体被各种细胞系摄取，并在细胞质中实现了红氧触发的货物释放。货物招募及随后的释放的多样性使得这些红氧响应共组凝聚体能够传递单一或组合的巨分子治疗剂，使这一细胞内递送平台成为治疗多种人类病理（如癌症、代谢性和传染性疾病）的有前景候选者。HBpep-SR共组凝聚体的另一个有用特性是其能够抑制RNase引起的mRNA早期降解，可能是因为一旦共组凝聚体形成，RNase无法扩散通过这些微液滴。值得注意的是，我们的方法不涉及内涵体逃逸或细胞膜融合（这两者是细胞内递送的主要机制8），而且这些共组凝聚体是微米级的载体，而不是当前大多数细胞内递送策略中使用的纳米载体。可以推测，通过LLPS获得的液态特性对其跨越细胞膜的能力至关重要，这导致了依赖胆固醇的摄取，尽管确切的进入机制仍不清楚，目前正在研究中。
货物招募和随后的细胞内释放的物理化学策略结合了pH响应肽的LLPS与自我解聚二硫化物化学。自我解聚链接器是将无巯基药物结合的有前景的分子工具，有助于触发其细胞内释放。本研究扩展了这一化学方法，作为精细调控肽共组凝聚相行为的一种方式，并且应适用于近年来表现出转化潜力的其他类型的相分离肽，如弹性蛋白样多肽。
未来的工作将旨在阐明肽微液滴的摄取和膜转运途径，并评估其在体内的安全性、有效性和组织分布。我们还设想，通过其他物理化学触发器可以诱导微液滴的解体和治疗剂的释放，这可能进一步拓宽它们在细胞内药物递送应用中的转化潜力。
方法：
材料
HBpep 肽、树脂和用于固相肽合成的 Fmoc 保护氨基酸均购自 GL Biochem。N-羟基琥珀酰亚胺、四氢呋喃、三苯甲烷、叠氮化钠、三苯甲烷和苯甲酸购自东京化学工业 (TCI)。N,N′-二异丙基氨基甲酸二酯、醋酸、2-羟基乙基二硫化物、N,N-二异丙基乙胺、哌啶、三氟乙酸、三异丙基硅烷、2,4,6-三硝基苯磺酸、谷胱甘肽、牛血清白蛋白、溶菌酶、沙波林、β-半乳糖苷酶、R-藻红蛋白、甲基噻唑基二苯基四唑溴化物、Hoechst 33342、甲基-β-环糊精、氯丙嗪盐酸盐、阿米洛利氯化物、单克隆抗-β-肌动蛋白过氧化物酶抗体、L-硫辛酸、还原型L-谷胱甘肽(GSH) 和 Pur-A-Lyzer Maxi 脱盐包 Maxi 50000 购自 Sigma-Aldrich。二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、LysoTracker Red DND-99、Opti-MEM、RNase A、Pierce 蛋白质转染试剂 (Pro-Ject)、Ni-NTA His Bind 树脂和 5-溴-4-氯-3-吲哚基 β-d-半乳糖苷购自 Thermo Fisher Scientific。Xfect 蛋白质转染试剂购自 Takara Bio。有机溶剂，包括乙酸乙酯、正己烷和二乙醚购自 Aik Moh Paints & Chemicals Pte Ltd。Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 (DMEM)、胎牛血清 (FBS)、磷酸盐缓冲盐水(PBS) 和抗生素-抗真菌 (100X) 液体购自 Gibco。用于荧光素酶检测的 Nano-Glo 双荧光素酶试剂盒和CytoTox 96 非放射性细胞毒性检测试剂盒购自 Promega。HyClone McCoy’s 5A 培养基购自 Cytiva。Trans-Blot Turbo 0.2-μm 硝酸纤维素转移包、4-20% Criterion TGX 无染色蛋白凝胶和 Clarity 及 Clarity Max Western ECL 底物购自 Bio-Rad。小鼠单克隆 p21 (F-5) 和 p53 (DO-1) HRP 抗体购自 Santa Cruz Biotechnology。多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白 HRP 购自 Dako。EGFP 在大肠杆菌 BL21 菌株中表达，并使用Ni-NTA His Bind 树脂进行纯化。用于 mRNA 转染实验的荧光素酶编码 mRNA 和 EGFP 编码 mRNA 购自 Trilink。HepG2、HEK293、A549、NIH 3T3、H1299 和 HCT116 细胞系购自 ATCC。T22 和 ARN8 细胞系根据以前的研究建立。
自免疫基团合成
与 HBpep-K 肽结合的自免疫基团是根据文献设计的（氨基反应物的合成路线见补充图 8）。首先，合成侧封闭的中间产物 HO-SS-R，将 2-羟基乙基二硫化物 (1 当量，10 毫摩尔) 溶解在 15 毫升四氢呋喃 (THF) 中，然后向其中添加 15 毫升含有羧酸反应物（如醋酸或苯甲酸）的 THF（0.9 当量，9 毫摩尔）。在冰浴下，缓慢将 15 毫摩尔 N,N′-二异丙基氨基甲酸二酯 (DIC) 加入反应混合物中。反应保持在 0 °C 下进行 0.5 小时，然后升温至室温。反应过夜后，将混合物过滤，超natant 在减压下蒸发。原料通过使用硅胶色谱法用乙酸乙酯/正己烷 (1/4) 进行纯化。通过旋转蒸发（R-215 Rotavapor, BUCHI）分离纯化产品。
中间产品 HO-SS-R 与 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 使用三苯甲烷偶联。具体来说，将 HO-SS-R (1 当量，5 毫摩尔) 和 4-二甲氨基吡啶 (DMAP，0.1 当量，0.5 毫摩尔) 溶解在 10 毫升 THF 中。然后将 0.37 当量 (1.85 毫摩尔) 的三苯甲烷以滴加方式加入到前面的溶液中，在冰浴下进行。再在冰浴下反应 0.5 小时，反应在 40 °C 下继续 4 小时，最后在减压下蒸发去除多余的磷酰。随后，NHS (1.5 当量，7.5 毫摩尔) 溶解在 20 毫升 THF 中，加入N,N-二异丙基乙胺 (DIPEA, 1.5 当量，7.5 毫摩尔)。反应保持在 40 °C 下进行 24 小时后蒸发。原料通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/正己烷 (1/3) 进行纯化。通过旋转蒸发分离纯化产品。氨基反应物 NHS-SS-Ac 和 NHS-SS-Ph 分别由醋酸和苯甲酸合成。HO-SS-R 和 NHS-SS-R 的化学结构通过 ^1H NMR 光谱进行了验证，如补充图 9 所示。NMR 谱图在 Bruker Advance 400 光谱仪上收集。
