研究进展：细菌中的蛋白质稳态受蛋白酶的调节,如十四聚体酪蛋白溶解蛋白酶P（ClpP）,其能够去除受损或错误折叠的蛋白质，在细胞稳态中发挥重要作用。然而，大量受ClpP蛋白水解影响的蛋白质仍然缺乏明确的降解共识，对ClpP底物的寻找高度依赖于蛋白质组学方法，尽管已在基因工程细胞中成功破译了ClpP的部分底物，但直接在天然细胞中捕获加工蛋白仍然难以实现。解决方案：在本文中，作者开发了一种与基因工程互补的化学捕获策略。合成了一种三功能活性位点捕获器，其结构中包含ClpP活性位点丝氨酸的结合单元苯基酯化合物，用于底物捕获和富集的炔烃手柄，以及光激活交联单元芳基叠氮化物（trap1）或三氟甲基二氮嗪（trap2）（图1A）。首先，作者证实这些化合物能够与ClpP活性位点结合并保持其蛋白水解活性（图1B），同时，对活细菌细胞中的ClpP具有选择性（图1C），这些都是用作多功能捕获探针的关键先决条件。接着进行了细胞中底物蛋白的捕获实验，在紫外光照射下利用探针对底物蛋白的光交联结合进行捕获并富集，发现两个探针总共显著富集了134个蛋白质（图2），其中包括了一些已知底物，验证了这种新方法的保真度。最后，通过平行反应监测（PRM）的靶向蛋白质组学，验证了捕获的特征蛋白是ClpP的底物，证明了靶向蛋白质组学在监测蛋白质蛋白水解方面的能力，以及这种新型揭示ClpP底物的方法的可靠性。![]()
图1：（A）探针trap-1和trap-2的结构示意图；（B）不同浓度trap-1和trap-2及抑制剂AV170孵育后ClpP蛋白的活性；（C）trap-1和trap-2标记金黄色葡萄球菌完整细胞的SDS-PAGE凝胶电泳。
![]()
图2：指数生长期金黄色葡萄球菌细胞用trap-1（左）或trap-2（右）处理后的富集蛋白火山图。
结论：本文开发了一种用于捕获ClpP底物的新型探针，其可以直接结合完整野生型细胞内的ClpP活性位点，保留其活性，并原位捕获底物，进一步使用靶向蛋白质组学方法验证了这些底物。该技术也有望开发为通用的即插即用工具，通过为目标的单个酶定制核心支架来捕获丝氨酸蛋白酶底物。参考文献：Stephan A. Sieber et al. A Photocrosslinking Probe to Capture the Substrates
of Caseinolytic Protease P. Angew. Chem.
Int. Ed. 2024, DOI:10.1002/anie.202409220.
