研究进展：目前，通过破坏化学键来实现分子功能转换的生物正交反应备受关注，其中通过1,2,4,5-四嗪（Tz）的点击反应对反式环辛烯（TCO）笼分子进行生物正交切割裂解具有高通用性、生物相容性和快速反应性。然而，开发高活性的四嗪，使其能够从反式环辛烯连接物中定量消除仍具有挑战性。点击释放方法是一种前药激活策略，其中四嗪试剂（Tz）的结构决定了整个点击释放过程的效率。一些有效释放的Tz如二甲基Tz、烷基芳基Tz和芳基-芳基Tz，有的点击反应性低，有的药物释放缓慢。研究揭示，酸性环境下Tz触发的rTCO笼状化合物裂解虽得以加速，却伴随着极低的点击反应活性。随后，研究人员利用NH3+作为分子内导向基团，发现氨功能化的四嗪可以加速释放但不完全释放。研究人员进一步将酚羟基定位在芳基取代的四嗪上，发现在2小时内可以实现近定量(≥95%)的Tz触发的rTCO消除。此外，具有氢键羟基或酰胺基团的双吡啶基四嗪被证明可以从抗体-药物偶联物中几乎完全释放药物分子。解决方案：基于此，作者通过氯磺酸合成得到二磺化四嗪，增加了酚羟基的pKa。在37 ℃的磷酸盐缓冲水溶液（PBS, pH 7.4)中，作者通过HPLC检测了双羟基吡啶基- Tz (OH-Pyr)2与磺化Tz 4 的生物正交裂解速率，发现两种四嗪都可以完全释放荧光团，但磺化Tz 4在两分钟内释放超过70%（图1A）。在铜催化条件下，通过丙炔取代的磺酰胺Tz与叠氮葡萄糖环加成反应，成功地对其进行了后期改性，为磺胺四嗪的功能化修饰开辟了途径。作者将水溶性磺基四嗪在37 ℃的PBS中孵育，并通过LC-MS及时分析溶液（图B），发现磺化四嗪相较于磺胺类化合物具有更高的稳定性。通过磺胺修饰来掩盖磺酸根的负电荷，可以制备具有细胞渗透性的四嗪，从而在几分钟内有效地切割活细胞内的rTCO和cTCO修饰的荧光团。此外，还通过在四嗪上修饰磺酸根实现了荧光团在细胞膜上的特异性激活（图2）。为验证其生物应用潜力，作者先用四嗪孵育细胞1小时，再加入不同浓度的阿霉素（rTCO-Dox）和嘌霉素（rTCO-Puro），通过细胞滴度-Glo测定细胞活力，结果表明三种四嗪嘧啶均能激活细胞内的rTCO-Dox。相比之下，磺基修饰的四嗪触发的前药激活明显较低，突出了细胞通透性的关键作用，证实了四嗪磺胺类药物在细胞内的有效释放。![]()
图1：（A）双羟基吡啶基- Tz (OH-Pyr)2与磺化Tz 4 的释放动力学示意图；(B)磺化四嗪在37°C PBS中的稳定性示意图。![]()
图2：通过LC-MS对磺化四嗪延迟释放分析示意图。
结论：作者在羟基四嗪中引入磺化基团，导致酚羟基的pKa值增加，促进了点击反应后的互变异构化和消除。它们可以通过生物正交反应在溶液和活细胞中触发化合物从反式环辛烯连接物中快速和完全释放。通过在羟基四嗪修饰不同的磺化基团，这些化合物在活细胞内和细胞表面表现出优异的释放性能。当前的临床试验正不断验证四嗪引发的键裂解反应的重要性，通过提高pKa值以加速消除反应的概念，将为设计更先进的生物正交工具提供新的思路。这些工具将在药物化学、化学生物学及生物医学研究中发挥重要作用，推动相关领域的发展与进步。
参考文献：Vrabel. M. et al.
Sulfonated Hydroxyaryl-Tetrazines with Increased pKa for Accelerated
Bioorthogonal Click-to-Release Reactions in Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 2024. DOI:10.1002/anie.202411713.
