研究进展：生物分子凝聚在调控细胞内多种生物学过程中扮演着关键角色，如信号传导、应激响应和基因表达调控。蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）是凝聚体形成和功能的基础，但这些相互作用的动态性和亚细胞定位的复杂性使得解析特定亚细胞区域内的PPIs成为一个挑战。当前的研究方法，如邻近标记技术，能够提供关于生物分子凝聚体组成的信息，但在直接研究PPIs方面存在局限性。这些方法依赖于反应性中间体的扩散，这可能导致非特异性的标记和对直接相互作用的低估。此外，特定位点的光交联探针（如DiZPK、Kcr*、o-NBAK、VL1等）虽然能够提供PPI界面的详细信息，但很难从单一选定位点全面分析凝聚体中的多价相互作用。代谢结合的光交联剂（例如，光亮氨酸、光乙硫氨酸）使特定氨基酸残基的蛋白质组级替换和PPI网络的全局固定成为可能。虽然这些光交联剂的短交联半径（即0-2 nm）和多位点结合适用于直接捕获多价PPIs，但在PPIs界面上相对较低的蛋氨酸和亮氨酸分布阻碍了这些探针在凝聚物中的应用。解决方案：在本研究中，作者开发了一种凝聚增强、空间定向、代谢结合辅助的光交联策略（如图1所示），称之为DenseMAP。DenseMAP利用优化的光赖氨酸探针（δ-photolysine），通过代谢途径整合到蛋白质中，实现活细胞内直接PPIs的光控生成。δ-photolysine允许蛋白质组范围内的结合和在活细胞中具有固定标记半径（R）的碳烯活性物质的光控生成。由于生物分子凝聚物内部高度拥挤，残基接近性增强，相互作用价（界面/位点）增加，基于δ-光赖氨酸的光交联非常适合于捕获和全局分析这些瞬态隔间内的直接PPIs。DenseMAP通过与生物素连接酶（BirA）定向的蛋白质标记和定量蛋白质组学相结合，获得了一个区室特异性的蛋白质相互作用组，揭示了SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白在应激颗粒（SGs）中的特定相互作用组（如图2所示），并阐明了磷酸化在病毒-宿主竞争中的功能作用（如图3所示）。此外，DenseMAP还揭示了核仁中颗粒组分（GC）阶段特异性蛋白质组，阐明了SUMO化（SUMO，小泛素样修饰物）在蛋白质质量控制中的关键作用。![]()
图1：DenseMAP光交联策略示意图。
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图2：DenseMAP捕获SG相关的交互组。（a）生物素标记与凝聚增强交联耦合分析POIs的SG特异性相互作用蛋白的示意图；（b）荧光成像显示；（c）Hsp90-AVI被生物素化，并与δ-光解氨酸代谢结合和UV照射的相互作用蛋白交联；（d）抗Hsp70免疫印迹分析Hsp90与链霉亲和素珠富集的交联蛋白。
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图3：N蛋白(SARS-CoV-2)与宿主RBPs之间SG特异性相互作用的磷酸化调控机制示意图。
结论：DenseMAP作为一种平台技术，为分析亚细胞和亚区域凝聚体中的功能PPIs网络提供了新的视角。它不仅能够揭示特定区域内的PPIs，还能够在多种生理和病理条件下应用，通过桥接蛋白质相互作用与亚细胞位置或翻译后修饰之间的联系，DenseMAP揭示了凝聚体中独特的调控机制，为操纵无膜细胞器的组装或物质交换提供了可能的途径。这项技术的发展有望推动对生物分子凝聚体在生理和病理条件下功能和调控机制的深入理解。参考文献：Kexin Li. et al. Spatiotemporal protein interactome profiling
through condensation-enhanced photocrosslinking. Nat. Chem. 2024.
DOI：10.1038/s41557-024-01663-1.
