研究进展：旁系同源蛋白源自基因复制，在约20,000个编码蛋白质的人类基因中，超过一半具有旁系同源物，它们在结构上相关联，功能上重叠但各有不同，有助于维持细胞系统的稳健性。先前的研究表明，一些小分子探针，可以通过共价化学以特定的选择性靶向不同的同源蛋白，以实现对同源蛋白的特异性活性，特别是针对特定亲核性氨基酸残基（例如半胱氨酸（N112C））的靶向。这种策略已经成功应用于激酶和RNA结合蛋白等多种蛋白质。许多这样的共价探针是通过结构引导的方法开发的，但也有一些是通过蛋白质组学研究发现的。最近，基于活性蛋白质表达谱（ABPP）对立体化学定义的亲电化合物（立体探针）的研究，已经在结构和功能不同的蛋白质中鉴定了许多同源限制性半胱氨酸的立体选择性共价配体。然而，这种方法通常局限于那些天然含有可以与亲电试剂发生反应的半胱氨酸的蛋白质，对于缺乏共价配体半胱氨酸的旁系同源物，是否可能具有适合可逆结合小分子的潜在口袋仍是一个问题。解决方案： 为了解决这一问题，作者提出了一种“同源蛋白跳跃”策略，即通过位点定向突变将ABPP发现的亲电敏感半胱氨酸引入到不含半胱氨酸的旁系同源物中，然后使用立体探针库进行筛选。如果在半胱氨酸突变蛋白上观察到立体选择性和位点特异性的共价结合，则认为该同源蛋白存在配体可结合口袋。随后，这些立体探针配体可以转化为高通量筛选（HTS）兼容的探针，用于鉴定能够可逆地结合到野生型（WT）同源蛋白的可逆结合化合物。在本研究中，作者将这种方法应用于CCNE2和CCNE1这两种细胞周期蛋白旁系同源物（如图1所示）。利用CCNE2中C109的共价配体性，将CCNE1中的相应残基突变为半胱氨酸，通过ABPP分析发现该突变体与色氨酸丙烯酰胺发生立体选择性和位点特异性反应。然后，将色氨酸丙烯酰胺-CCNE1-N112C相互作用转化为体外NanoBRET（生物发光共振能量转移，如图2所示）和基于纤维素的ABPP分析测定，用于识别可逆抑制N112C突变体和野生型CCNE1：CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶2）复合物（结构如图3所示）的化合物。![]()
图1：“同源蛋白跳跃”策略应用于CCNE2和CCNE1的原理示意图。
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图2：（a）NanoBRET立体探针YZ-01-A和炔烃类似物WX-02-588的结构，以及相应的对映异构体YZ-01-B和WX-02-589；（b）NanoBRET测定立体探针与CCNE1-N112C相互作用的示意图。
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图3：（a）CCNE1：CDK2（绿：蓝）复合物的带状图结构，其中 I-198 化合物为橙色，ATP 结合口袋为黑色（星号），CDK2 A环为米色，N112为紫色；（b）I-198结合位点、蛋白质-配体相互作用和到N112 的距离的详细视图（用虚线表示）；（c）CCNE1：CDK2和I-198之间的蛋白质-配体相互作用图，CCNE1 和CDK2残基分别以绿色和蓝色显示，水分子以水红色显示。
结论：在本研究中，作者通过“同源蛋白跳跃”策略，成功地鉴定了能够与CCNE1-N112C突变体结合的色氨酸丙烯酰胺类立体探针配体，发现这一探针与最近报道的CCNE1:CDK2复合物的可逆抑制剂显示出竞争性结合，结构研究进一步揭示了这些可逆抑制剂的结合位点位于CCNE1与CDK2的界面附近。这一发现不仅为理解蛋白质配体提供了新的视角，而且为开发针对这些隐蔽变构口袋的小分子药物提供了重要的结构基础。参考文献：Zhang, Y. et al. An allosteric cyclin E-CDK2 site mapped by paralog
hopping with covalent probes. Nat. Chem. Biol. 2024. DOI：10.1038/s41589-024-01738-7.
