研究进展：脂滴（LDs）是参与细胞内脂质储存和能量代谢的重要细胞器，能够传导信号并参与各种疾病过程。然而，由于其体积小，变化迅速，往往需要在纳米尺度上观察LD之间、LD与其他细胞器之间的相互作用，传统的成像技术难以准确实时地捕捉这些动力学。荧光探针可以专门针对具有高灵敏度，时间和空间分辨率以及光稳定性的LD，以实现长期超分辨率成像。光漂白是由活性物质氧化荧光团引起的，对LD的长期超分辨率成像提出了持续的挑战。因此，研究人员引入了各种缓冲探针来减轻超分辨率成像中的光漂白问题，当目标结构内的探针发生光漂白，储层中附近的荧光团可以有效地取代褪色的荧光团，以确保长时间稳定的超分辨率成像。解决方案：通过使用Clog P（一种评估脂质溶解性的参数），作者发现Clog P值在2.5到4之间的荧光染料具有最佳的缓冲能力LD染色（图1）。同时，作者通过筛选荧光染料发现了四种不同颜色的LD缓冲荧光探针，分别命名为LD-BFP405、LDBFP450、LD-BFP488和LD-BFP543。通过体外模拟实验，这些探针被证明具有中等的脂溶性和高光稳定性，可以对脂滴进行免水洗成像。接下来，作者在萘酰亚胺支架上引入不同的亲疏水性基团以调节其Clog P值，并将萘酰亚胺-LD-BFPs与活细胞孵育。作者发现Clog P<2.5的萘酰亚胺-LD-BFPs表现出“LD亲水性”，不能有效靶向LD，Clog P>4的表现为“LD疏水性”。通过观察光漂白后的缓冲荧光恢复实验（图2），结果证明2.5<Clog P<4的亲脂性范围是萘酰亚胺-LD-BFPs的最佳“LD缓冲窗口”。利用结构照明显微镜（SIM），作者发现在铁下垂过程中，过表达的ACSL3蛋白会分泌到囊泡的细胞质中，LD通过与囊泡的膜融合作为表达蛋白的储存位点。使用LD-BFP405标记LD，作者观察ACSL3囊泡与LD相互融合，且LD表面上mCherry的荧光强度显著增加（图3）。此外，这些蛋白质可能进一步与溶酶体等细胞器相互作用或通过脂质吞噬被降解以维持细胞稳态。![]()
图1：以Clog P为指导设计的LD-BFPs示意图。
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图2：2 μM LD-BFPs在活细胞中的连续BuFRAP实验示意图。
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图3：铁下垂中LD与标记后的ACSL3囊泡的膜融合示意图。
结论：总之，本研究强调了亲脂性对LD-BFPs缓冲能力的重要影响，Clog P值在2.5~4之间的荧光染料可以在LD外形成缓冲池，取代LD内的光漂染料并保持其荧光强度。作者还开发了四种多色LD缓冲荧光探针，用于LD的超分辨率动态成像。利用SIM成像，作者观察到LD在铁下垂期间作为蛋白质“招募者”和“中转站”的功能。LD招募蛋白与其他细胞器之间的相互作用对细胞内稳态至关重要。这些发现有助于揭示LD在细胞生物学中的新作用。参考文献：Xu J C. et al. Clog
P-Guided Development of Multi-Colored Buffering Fluorescent Probes for Super-Resolution
Imaging of Lipid Droplet Dynamics. Adv
Sci. 2024, DOI: 10.1002/advs.202408030.
