研究进展：泛素化（PTM）是指泛素（一类低分子量的蛋白质）分子在一系列特殊的酶作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并对靶蛋白进行特异性修饰的过程。这种修饰过程在许多细胞中起着至关重要的作用，包括蛋白质的蛋白酶体降解和基因组稳定性的维持。二磷酸腺苷核糖基化（ADPr）则是一种PTM，主要以调节DNA修复过程而闻名，但也被广泛认为是泛素化的信号。近期以来，科研工作者们对二磷酸腺苷核糖基化调控泛素化的兴趣也越来越大，因为他们在对二磷酸腺苷核糖基化调控泛素化的研究中，发现了一类多结构域的嗜肺军团菌效应酶，这些效应酶在复制的过程中可以将两种特异性修饰通过物理的方式连接在一起，从而在宿主细胞内进行有效地复制。尽管最近对于该方面有机分子的研究取得了充分的进展，如小分子抑制剂、UbADPr底物、稳定剂UbADPr-analogues和荧光偏振测定试剂等，但由于目前可用的大多数工具都是用于分离的重组蛋白，且迄今尚未开发出靶向pr泛素化机制的探针，因此这是一个十分值得研究的方向。解决方案：在这项工作中，作者利用了一个叠氮化合物修饰的人工合成的Ub蛋白，该蛋白经由铜催化，和多种带有反应性基团的炔丙基修饰的核糖分子，Ub蛋白和核糖分子之间发生点击反应，由此生成了一个小的探针库来共价捕获军团杆菌Dup家族（如图1所示）。这种方法不仅可以方便快捷地获得各种共价探针，而且在反应的过程中，Ub蛋白和核糖基团之间可以发生水解，形成了稳定的三氮唑键，促进了探针在细胞环境中的应用（如图2所示）。随后作者尝试将反应活性最高的探针应用于军团杆菌感染的HEK293T细胞，进行了细胞裂解物的pull-down实验，这项实验显示出对靶向军团菌效应酶的优异富集，突出了他们的探针在复杂生物环境中研究军团菌效应酶的适用性。![]()
图1：评估探针1 - 5与重组DupA WT的反应。（A）Dup活性的部分催化机制示意图；（B）SDS-PAGE凝胶显示探针1 - 5与DupA WT之间形成复合物；（C）DupA：探针6配合物的质谱数据。
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图2：共价DupA：探针复合物的突变和晶体学研究。（A）Dup A的突变及其对罗丹明标记的乙烯基磺酸盐探针5的反应性；（B）Dup A：探针6配合物晶体结构概述；（C）Dup A (红色)与Ub探针6 (绿色)之间交联区域(青色)的结构和电子密度。
结论：作者开发了一种化学方法用于生成泛素磷酸核糖类似物，这些泛素磷酸核糖类似物可作为靶向军团菌Dup效应分子的共价探针，即高活性的乙烯基磺酸盐探针，这种探针可以与重组Dup A发生共价反应，且反应过程实现了快速、完全的转化。虽然乙烯基磺酸盐探针最初是为了靶向Dups的催化组氨酸而设计的，但是研究表明探针5对Cys196残基的反应活性较高。并且，作者通过对该探针进行的结构分析，证实了Dup A与PR-Ub衍生探针之间形成稳定连接的非催化Cys196的共价交联。因此，科研工作者们对于Ub和ADPr在人体细胞中的相互作用以及探针的应用的研究，将有助于揭示生命体在正常稳态和细菌感染条件下涉及的一些分子机制。参考文献 Kloet, M. et al. Covalent Probes to Capture Legionella pneumophila Dup Effector Enzymes. J. Am. Chem. Soc. 2024. DOI:10.1021/jacs.4c08168.
