研究进展：γ-氨基丁酸A型受体（GABAARs）是哺乳动物中枢神经系统（CNS）中主要的抑制性突触受体，是药物研究的重要靶点。GABAAR激动剂和增强剂（positive allosteric modulators，PAM），尤其是苯二氮平类药物，如巴比妥酸盐，已广泛应用于治疗肌肉痉挛、酒精戒断、失眠、焦虑、谵妄和癫痫发作，以及诱导镇静和麻醉。异丙酚是一种专门用于全身麻醉的GABAAR PAM。双库兰和加巴嗪等GABAAR拮抗剂可作为功能性解剖神经元GABAAR电流组分和行为表型的研究工具。脊髓背角中表达GABAAR的神经元是调节感觉信息和疼痛感觉的关键元件，背角中复杂的局部抑制回路也被称为外周感觉信息的“门”，该脊髓区域中抑制性传递的下调会导致慢性疼痛的发生。因此，GABAAR作为神经抑制回路的驱动因子，在脊髓和其他CNS区域中起着至关重要的作用。研究人员已经证明用化学基团修饰的药物能在不同波长的光下改变蛋白质结构，可以控制蛋白质活性、细胞和组织的功能以及动物行为。这些基团被称为光开关。偶氮苯便是其中之一，它在N=N双键的E和Z构型之间进行可逆地光异构化，并改变其长度和偶极矩。这些光开关基团可以通过设计偶联到具有合适药理特性的生物活性分子上，如激动作用、拮抗作用和调节作用，从而产生强大的分子工具来研究生理过程和开发新的治疗方式。一个成功的光药理学设计策略包括用偶氮苯（偶氮苯类似物或“偶氮化合物”）直接取代药物中的联芳基酰胺或联芳基醚，赋予母体化合物光控活性，同时在很大程度上保留所有其他有价值的分子特性。研究人员尽管在开发GABAAR光药理学方面已经投入了大量的努力，但仍然需要寻找一种在黑暗中不活泼，而在光照下对野生型哺乳动物显示出治疗效果的GABAergic光转换激动剂-增强剂。迄今为止，在小鼠中测试的唯一GABAergic化合物是光开关拮抗剂，但是其必须通过位点定向突变，从而共价地连接到引入了GABAAR亚基的半胱氨酸残基上。因此，研究人员需要将其敲入小鼠，这有利于抑制性神经传递的基础研究，但不利于在野生型动物（包括人类）中治疗应用的开发。栓系方法也被应用于异丙酚激动剂的体外实验，包括暗无活性和暗活性栓系位点。此外，所有已报道的可自由扩散的GABAAR光开关都是暗活性的（针对通道孔GABA位点或异丙酚位点），除了氟西泮—黑暗中无活性的GABAAR增强剂。偶氮异丙酚对蝌蚪的麻醉活性在360nm光下减弱，氟西泮允许光控制斑马鱼的运动。然而，这些配体都没有在啮齿动物身上进行过试验。因此，对于GABAARs的暗无活性光开关激动剂-增强剂，目前的研究尚未满足其在哺乳动物中产生光抑制作用的需求。解决方案：为了解决以上的问题，作者通过用偶氮基团取代醚键，设计了一种偶氮苯类似物（称为偶氮卡尼）。在没有能够结合阿贝卡尼受体的原子结构的情况下，作者使用分子对接计算来测试该修饰是否与受体结合相容，以及Z和E异构体之间的结合是否存在差异。计算结果表明，Z-偶氮卡尼与阿贝卡尼和地西泮类似，可以结合在苯二氮平位点，表明Z-偶氮卡尼可以充当增效剂而E异构体则不能（图1）。![]()
图1：阿贝卡尼、偶氮卡尼的Z/E异构体在GABAA受体的苯二氮平结合位点的分子对接计算示意图。
随后，为了进一步证实上述结论，作者通过吸收光谱来表征偶氮卡尼的光化学性质。结果表明，偶氮卡尼可以在Z和E异构体之间进行可逆地切换（图2），而在黑暗中热松弛后，E异构体在偶氮卡尼溶液中的含量为100%。在海马神经元中，作者通过在不同照明条件下使用全细胞膜片钳电生理技术评估了该化合物的体外光药理学特性，通过测量全细胞宏观电流和瞬时微型抑制性突触后电流（mIPSCs）来测试E-和Z-偶氮卡尼对培养神经元内源性GABAARs的影响。实验结果表明，偶氮卡尼在黑暗中不活跃，在400 nm光下，能作为GABAARs的微摩尔激动剂-增强剂，产生宏观GABAergic电流，并延长培养海马神经元突触电流的衰减时间（图3）。![]()
图2：偶氮卡尼异构体的可逆切换（ΔT表示黑暗中从Z到E的热松弛）。
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图3：偶氮卡尼对培养的原代海马神经元中内源性GABAergic电流的影响；（A）GABAergic电流的电压钳记录（400 nm和500 nm光的照明分别用紫色和绿色方框表示）；（B）添加偶氮卡尼（25 μM）和添加GABAAR孔阻断剂picrotoxin（PTX,100 μM）后的对照GABAAR电流；（C）同时应用不同浓度的偶氮卡尼和400 nm照明时所记录的宏观GABAergic电流的相对平均振幅的累积图；（D）两组不同实验中宏观GABAergic电流的平均振幅累积图；（E）偶氮卡尼（25 μM）在400 nm光下增加了mIPSCs的衰变时间。
最后，作者在体内测试了光激活偶氮卡尼对脊髓痛觉的影响—用von Frey纤维评估小鼠对左后爪足底侧机械刺激的敏感性。鞘内注射偶氮卡尼后，在405 nm连续光刺激下进行von Frey灯丝测试，显示机械灵敏度明显下降。停止照明1小时后再次进行von Frey灯丝测试，显示恢复到基线机械灵敏度（图4），表明注射后小鼠后爪灵敏度显著降低，但运动协调不受影响。因此，偶氮卡尼能有效控制小鼠的机械敏感性，无不良反应。![]()
图4：（A）利用von Frey灯丝试验测量机械灵敏度变化的实验装置；（B）前基线戒断阈值示意图；（C）旋转棒试验中评估的运动协调性的示意图。
结论：综上所述，作者设计了一种偶氮苯类似物—偶氮卡尼，保留了与苯二氮平的结合和其前体阿贝卡尼的其他有利特性，并且在光照的Z异构体下建立了更强的受体-药物相互作用。偶氮卡尼在黑暗中具有较低的GABAAR活性，在体外和体内均受可见紫光的光激活，并且在小鼠鞘内注射时不会产生全身不良反应。因此，偶氮卡尼是一种可自由扩散的药物小分子光开关，可以进一步开发用于局部神经抑制等的治疗目的。参考文献：Mercedes Alfonso-Prieto and Pau Gorostiza et al. Light-Activated Agonist-Potentiator of GABAAReceptors for Reversible Neuroinhibition in Wildtype Mice. J. Am. Chem. Soc. 2024, 4c08446.
