研究进展：重氮肽的多功能反应性激发了化学家和生物化学家的想象力。C端肽重氮基甲基酮2（I）和N末端N-重氮酰基肽（II）已被制备和研究为不可逆酶抑制剂、光亲和蛋白探针、环加成物和潜在的抗癌药物。然而，3
N 末端重氮肽和 C 末端重氮甲基酮对酸不稳定，并且在酸性活化、辐射和形成过渡金属卡宾时与各种亲核试剂发生反应。因此，化学性质稳定的重氮肽的制备仍然是一个挑战，并且具有很高的潜力，
因为所获得的产物可能适合与蛋白质表面和结合位点进行选择性反应。解决方案：为了解决以上问题，作者开发了化学稳定的内部重氮肽的制备、性质和应用。发现肽基磷亚烷基酯和酰胺与叠氮三苯甲基反应主要生成新的4，5-二取代的1，2，3- 三唑基肽。壬基叠氮化物取代了重氮肽，在pH 1-14的范围内具有良好的化学稳定性（图1）。通过固相肽合成制备的重氮肽在使用 95% 三氟乙酸的最终脱保护时保持稳定。具有人胱天蛋白酶-3识别序列的重氮肽被鉴定为低纳摩尔浓度下该酶的特异性、共价和不可逆抑制剂。荧光重氮肽进入活细胞，可通过流式细胞术对凋亡细胞进行显微成像和定量。因此，内部重氮肽构成了一类新型的基于活性的探针和酶抑制剂，可用于化学生物学和药物化学。
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图1：4,5-取代的三唑基肽和重氮肽的合成路线图
结论：总之，本工作建立了化学稳定的重氮肽和 4,5- 二取代三唑基肽的合成途径，都能通过可溶性或聚合物负载的酰基-膦酰亚胺酯和酰胺与缺电子叠氮化物的偶极环加成反应获得，然后在重氮肽下打开中间环结构。重氮肽卓越的化学稳定性使其能够在生理条件和活细胞中应用。携带人半胱天冬酶-3识别序列的重氮肽被鉴定为共价和不可逆的抑制剂，IC50 值在低纳摩尔范围内，对活性酶具有高选择性。相同序列的荧光重氮肽可用于凋亡细胞的成像和定量。这种应用可以扩展到在活性位点具有反应性亲核体的其他蛋白质，包括其他半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶。参考文献： Wahl J, Ahsanullah A, Zupan H, et al. Chemically Stable
Diazo Peptides as Selective Probes of Cysteine Proteases in Living Cells. Angew.
Chem. Int. Ed. 2024, e202411006.
