研究进展：基因表达是最基本的生物现象之一，使用化合物对转录进行光学调节是在时空上操纵基因表达的有效策略，该策略因其在调节基因表达方面的多功能性而引起了人们的广泛关注。在过去的几十年里，研究人员通过在生物活性分子（如小化合物、核酸、和蛋白质）上安装光可移除保护基团（PPG）来开发光介导的转录调控系统。该基团通过与目标生物分子结合并封闭目标生物功能所需的位点来阻断原始功能，且该位点能在暴露于解开分子的光下恢复。目前，研究人员已经开发包括邻硝基苄基和香豆素衍生物在内的几种PPG，并成功用于转录的光调节。这种方法虽然能够实现转录的调控，但也存在一些局限性。由于PPG的解笼效率低，通常需要强烈且长时间的紫外光照射，这可能会对细胞造成不良损害，以及会得到有毒的光产物。对于效应分子，该策略无法监测其活性状态，即无法通过视觉区分效应分子的状态是笼式还是非笼式。因此，转录激活细胞的定量分析是一项重大挑战。在金黄色葡萄球菌中发现的QacR被归类为TetR家族转录调节因子（TFTR），其作为转录抑制因子，通过干扰操纵子序列IR1来调节抗生素外排泵的基因表达。解决方案：为了解决技术缺陷，作者开发了一类新型光学转录调控系统，以检测效应分子的活动状态，其中光可激活的荧光团作为转录因子的效应子而发挥作用。首先，作者选择了硅桥氧杂蒽酮（PaX560）作为光可激活染料，且在几种PaX560衍生物中选择了具有α-甲基乙烯基取代基的衍生物，因其表现出最快的光活化；采用正电荷采集并以光学方式调节多药物结合转录调节因子（QacR）的活性，使用PaX560作为QacR的配体对QacR活性进行光调节，以控制靶基因的转录。对QacR- PaX560复合物的结构分析表明，配体结合口袋中的疏水和阴离子氨基酸残基通过π-π、π-阳离子和离子相互作用，能够稳定阳离子化合物的结合。此外，QacR的大体积配体结合口袋使其可以灵活结合配体，以上结果证实了PaX560-CF是PaX560的阳离子形式。为了验证PaX560-CF对QacR的亲和力强于中性和非荧光PaX560，作者通过等温滴定量热法（ITC）测量了这些化合物的解离常数，结果证实，与中性PaX560相比，阳离子PaX560-CF对QacR的亲和力显著升高（图1），使其成为转录因子的理想光控效应子。![]()
图1：在相同条件下使用两个配体（A）PaX560和（B）PaX560-CF滴定QacR示意图。
随后，由于QacR可识别位于启动子序列直接相邻的操纵子序列（IR1），从而阻止RNA聚合酶（RNAP）-启动子复合物转变为转录生产状态，作者新开发了一种PT7/QacR启动子系统，该系统允许T7RNAP的转录起始受到QacR的调节，且随着PT7和QacR识别所需的最小IR1（IR1 mini）碱基之间的碱基数量的减少，QacR的转录抑制逐渐增强（图2）。对于光介导PaX560向PaX560-CF转化，作者通过测量细菌培养物的发光强度来实时监测荧光素酶的表达水平，评估其是否可以抑制体外T7转录测定中QacR转录抑制的活性。结果表明，荧光素酶的活性水平在光照射约300 min后达到最大值，且在50 μM PaX560下，诱导速率相对于未照射的对照组增强了42倍（图3），其验证了在低强度可见光照射下，PT7/QacR系统可光活化PaX560，从而激活活细菌细胞中的基因表达。在没有光照射的情况下，可光激活染料保持非荧光并且无法减轻QacR的转录抑制。光照射和不照射之间荧光强度的明显差异,确保了PT7/QacR系统的转录仅在显示红色荧光的大肠杆菌细胞中被激活，表明来自PaX560-CF的荧光信号是一个能够识别效应分子的活性状态重要指标。![]()
图2：（A）四个构建体序列1-4，用于优化PT7和IR1序列之间的间隔碱基数量;（B）对转录的RNA定量分析示意图;（C）光激活体外转录分析图。
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图3：（B）光照射和（C）无光照射的大肠杆菌中的光激活荧光素酶表达示意图;（D）活化的PaX560分子的荧光（粉红色）提供的光照射记忆图;（E）在大肠杆菌中有无光照射下的PaX560光活化和超级折叠绿色荧光蛋白表达的荧光成像。
结论：综上所述，作者开发了一类新型的光化学转录调控系统—使用无笼基的光激活染料PaX560作为效应分子，QacR作为转录调节因子。该系统优于使用笼状化合物的常规转录调控系统，因为它的激活既不需要强烈的紫外线照射，也不产生可能干扰生物体分子机制的副产物。该系统在生物医学、系统生物学和功能基因组学中的应用具有巨大潜力，有望无缝集成到无细胞系统领域，例如脂质体中封装的转录/翻译系统的时空激活以及从合成细胞远程控制生产和递送基因产物等。参考文献：Kazuya Kikuchi et al. Light-Activated Gene
Expression System Using a Caging-Group Free Photoactivatable Dye. Angew.
Chem. Int. Ed. 2024, DOI: 10.1002/anie.202416420.
