研究进展：B细胞白血病是常见的血液肿瘤之一，部分患者在治疗过程中会出现耐药性和复发。在区分易感和耐药的癌性B细胞的分子特征中，功能性趋化因子受体CXCR5只在成熟B细胞中表达，而受体CXCR3与侵袭性和耐药性直接相关，但目前还没有化学策略来选择性地靶向耐药白血病细胞的不同趋化因子特征。双锁和AND门分子设计是一种新兴的探针，可同时识别多种生物标志物来提高靶标选择性。先前报道的用于成像免疫细胞的AND门荧光探针只能针对单一类型的细胞表面受体，无法报道耐药性概况。生物正交策略可以对亚细胞的细胞器、聚糖和其他代谢物进行荧光标记。含四嗪的探针已被报道用于光活化降解和抗体靶向，但其受功能性G蛋白偶联受体表达的空间控制。解决方案：作者设计了一个合成方案来功能化氟硼二吡咯（BODIPY）荧光团（图1）。首先，作者将3-溴-5-羟基苯甲醛烷基化得到中间产物1，并用它在标准缩合中分离出BODIPY化合物2。作者接着在BODIPY核心中引入一个硼酸基团，在酸性下水解得到化合物3。化合物3经过改良的Liebeskind-Srogl交叉偶联，加入甲基四嗪猝灭剂去除邻苯二胺保护基团，并与马来酰亚胺功能化的PEG间隔剂反应，得到BODIPY5作为趋化因子衍生的荧光试剂。通过荧光分析和HPLC-MS，作者研究了四嗪BODIPYs与反式环烯醇和内切-9-羟甲基-双环[6.1.0]非4-炔（BCN）的反应，发现反应均进行得很快。四嗪-BODIPY4与BCN之间的反应有更高的荧光增强，且在短时间内观察到明亮的细胞内信号（图2A）。然后，作者将趋化因子CXCL13（hCXCL13）和CXCL10（hCXCL10）偶联到马来酰亚胺功能化的四嗪-BODIPY5上，通过SDS-PAGE和凝胶内荧光扫描发现BODIPY5的四嗪基团的反应活性保持不变。作者还制备了互补的含BCN的趋化因子偶联物，用于串联连接白血病B细胞。作者接着对耐药WSU-NHL细胞进行时间过程流式细胞术分析，发现其显示明亮的荧光，这证实了该标记策略在快速荧光检测中的实时成像能力。通过活细胞显微镜，作者发现hCXCL13-5和hCXCL10-BCN的共添加导致耐药WSU-NHL B细胞与非耐药Raji B细胞的不同（图2B）。最后，作者在WSU-NHL和Raji细胞的混合共培养中测试了趋化因子组合的选择性，仅在WSU-NHL细胞中观察到荧光信号。![]()
图1：用于趋化因子结扎和活细胞成像的BODIPY氟-激活剂对的合成示意图。
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图2：（A）MCF-7细胞经化合物4和BCN孵育后的时程荧光显微镜图像示意图；（B）白血病B细胞内趋化因子在添加hCXCL10-BCN和hCXCL13-5后结联的实时成像示意图。
结论：总之，作者在快速趋化因子连接的基础上设计了一个新的生物正交成像平台，首次针对耐药白血病B细胞亚群，优化后的四嗪-BODIPY氟化物能够在几分钟内达到40倍的荧光放大。接着，作者证明了趋化因子偶联物保留了原有功能，使得白血病B细胞的时间过程流式细胞术和共聚焦显微镜成为可能。而且，hCXCL13-5和hCXCL10-BCN组合对耐药B细胞而具有快速和选择性的细胞内标记，证明了其在实时区分相近免疫细胞群体中的实用性。这种串联连接策略的模块化可以扩展到具有不同趋化因子特征的其他免疫细胞和其他受体对，为具有增强时空分辨率的新活细胞免疫分型技术铺平道路。此外，该平台原则上可以用于点击释放策略，从而能够将治疗有效载荷精确地递送到肿瘤细胞亚群。参考文献：Vendrell M. et al.
Chemo-Click: Receptor-Controlled and Bioorthogonal Chemokine Ligation for
Real-Time Imaging of Drug-Resistant Leukemic B Cells. J Am Chem Soc.2024, DOI: 10.1021/jacs.4c12035.
