研究进展：现代荧光显微镜已经从固定标本的3D成像发展到活细胞或动物中亚细胞结构或动态细胞过程的4D记录。然而，研究人员在高分辨率下进行延时记录，使活体样品受到的光剂量显著升高，已超过了典型的单次宽场或共聚焦成像实验中采用的水平的几个数量级。相关研究已知荧光标记的高激发光暴露会损害生物样品的生理完整性。该现象被称为光毒性，是光和荧光团对其周围环境的可逆或不可逆的破坏性作用。在活细胞荧光显微镜下，与光毒性相关的主要ROS是单线态氧，它是由激发的荧光团和分子氧反应后产生的产物。活性单线态氧可以氧化附近的生物大分子，如脂质、碳水化合物和核酸，从而影响它们的生理功能。这种有害影响会随着时间的推移而积累，导致细胞代谢异常、细胞器和生物体变形、细胞增殖停滞以及细胞凋亡。因此，光毒性是一种普遍现象，其潜在的侵入性将广泛影响活细胞荧光成像实践。随着超分辨率成像和延时成像仪器的普及，最小化光毒性对于支持生物成像的生理相关性变得越来越重要。从光物理化学的角度来看，研究人员通常认为光毒性和光漂白源于激发态三重态。三态猝灭剂（TSQs），例如巯基乙胺（MEA）或环己四烯（COT），则在活细胞荧光成像中作为保护剂有着丰富的历史。在过去的十年中，这种TSQ片段在选择的染料支架上的直接偶联的策略已被用来提高光稳定性，特别是在使用花菁染料的单分子成像中得到证实。但最近的研究发现，其中光毒性已成为光漂白的补充威胁。罗丹明染料具有优异的光物理特性、光谱可调性和细胞通透性，近年来在活细胞荧光成像领域占据主导地位。为了满足荧光纳米学日益增长的需求，染料的光物理特性，如亮度、光稳定性、和闪烁得到了进一步的工程设计。最重要的是，罗丹明可以与多种标记技术结合使用，例如用于点击化学的四嗪，这种协同发展也巩固了罗丹明作为生物成像主流工具的地位。解决方案：为了解决以上的问题，作者设计了一种通用的TSQ偶联策略，以降低罗丹明衍生物的光毒性。首先，作者选择了COT和硝基苯作为代表性TSQ，并合成了它们的罗丹明衍生物。环辛烯-1-甲醇与其下悬环上不同位置的四甲基罗丹明（TMR）偶联，得到化合物2-4，硝基苯甲醇与3-羧基TMR偶联得到化合物5。（图1）![]()
图1：四甲基罗丹明-TSQ（TMR-TSQ）探针的化学结构示意图。
随后，作者从光稳定性、体外单线态氧生成、基于细胞凋亡的光毒性三个方面对TSQ-TMR偶联物和参考化合物TMR甲酯（TMRM，化合物1）进行对比评价。首先，在模拟两亲性细胞环境的有机聚合物膜中，化合物1-4表现出高光稳定性，而化合物5（硝基苯衍生物）更容易发生光漂白。接下来，所有TSQ偶联染料都表现出单线态氧生成减少（图2）。最后，作者用化合物1-5对HeLa细胞进行染色，以通过光诱导细胞凋亡测定评估光毒性。这些染料的正电荷导致线粒体内产生明亮的荧光信号，线粒体是一种容易受到光损伤导致细胞凋亡的细胞器。使用高内涵成像仪和碘化丙啶（PI）染色评估细胞凋亡。总之，在筛选的异构体中，化合物2可以实现最大的光毒性降低，与化合物1相比，这种探针可以将延时记录的持续时间延长约五倍，而不会影响光稳定性（图3），因此作者将其命名为温和的罗丹明GR555-mito。![]()
图2：化合物1-5在520-530 nm LED光照射下的绝对单线态氧量子产率（ΦΔ）。
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图3：HeLa细胞中，化合物1-5的活细胞光毒性测量。
在确定2为温和的罗丹明染料后，我们通过6-羧基琥珀酰氨基酯将其与小麦胚芽凝集素（WGA）偶联，得到GR555-PM，一种用于活细胞质膜的明亮荧光标志物（图1e，f）。在高内涵成像仪中监测其与WGA-TMRM相比的细胞光毒性。结果表明，携带COT的变体GR555-PM在10 min光照以及半致死剂量下的细胞光毒性降低了4倍。该测定证实了COT偶联的罗丹明的光毒性降低，同时呈现实用且温和的膜染色（图4）。![]()
图4：HeLa细胞中WGA-TMRM和GR555-PM的活细胞光毒性测量示意图。
接下来，作者将其设计拓展到其他常用的罗丹明衍生物。通过对多种COT偶联的罗丹明衍生物的检测结果表明：COT偶联降低了不同颜色的罗丹明衍生物的体外单线态氧产生和细胞光毒性；基于罗丹明-COT的线粒体染料补充了其花菁素对应物（例如PK Mito染料）在线粒体的结构成像；COT偶联策略降低了细胞光毒性，并最终最大限度地减少了活细胞显微镜中的DNA损伤（图5）；COT偶联的肌动蛋白探针能够以低光毒性对细胞结构进行长期成像（图6）。![]()
图5：（d）HeLa细胞的活细胞共聚焦图像，点状物的形成表明DNA损伤水平（绿色）。（e）HeLa hXRCC1-GFP细胞光毒性的半定量分析示意图。
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图6：（f）肌动蛋白染料MaP555-肌动蛋白（蓝色）和COT偶联的GR555-肌动蛋白（橙色）染料的化学结构。（g）用MaP555-肌动蛋白或GR555-肌动蛋白标记HeLa细胞的长期延时共聚焦记录图（用GR555-肌动蛋白标记的细胞在记录期间没有显示肌动蛋白丝的收缩和断裂）。
结论：综上所述，作者证明了罗丹明染料在活细胞成像领域的巨大潜力，确定了一种产生温和罗丹明的通用策略，该策略保留了其出色的光谱特性和细胞通透性，同时显示出其有效减少单线态氧的形成和减少细胞光损伤的能力。在未来，这些化学方法最终将会与数学、光学和光谱方法协同作用于实现延时动态成像，提供更持久的荧光信号。
参考文献：Zhixing Chen et
al. Gentle Rhodamines for Live-Cell Fluorescence Microscopy. ACS
Cent. Sci. 2024, DOI:
10.1021/acscentsci.4c00616.
