研究进展：蛋白质的三维超分子手性腔能够用于精确控制具有挑战性的有机反应中的选择性，特别是能在光催化中处理瞬态的自由基中间体。然而，由于手性小分子催化剂的高反应性和自由扩散特性，有关手性小分子催化剂的应用通常具有挑战性。光酶为应对这一挑战提供了一种很有前途的解决方案，它们可以通过合理的设计和定向进化进行精确定制，创建一个量身定制的手性口袋，以容纳具有高对映诱导的底物。然而，尽管取得了重大进展，天然和人工光酶中光辅因子的多样性有限。遗传密码扩展技术为解决这个问题提供了一种强大的方法，然而，该技术通常需要多轮序列工程、筛选和选择，使其成为一项耗时且劳动密集型的工作。解决方案：在本文中，作者报告了一种化学遗传学方法来创造多样化的人工光酶，该方法整合了蛋白质的位点特异性化学修饰和定向进化。作者首先选择转录因子乳球菌多药耐药调节剂（LmrR）作为蛋白质支架，其同源二聚体疏水口袋已被证明有利于容纳吲哚底物。接着，作者计划采用碘乙酰胺-半胱氨酸生物偶联化学方法共价包埋合成光敏剂。然而，LmrR缺乏游离半胱氨酸，因此，选择朝向腔内的氨基酸残基F93进行半胱氨酸诱变。诱变后的LmrR分别与二苯甲酮（3a）、氧杂蒽酮（3b）、硫杂蒽酮（3c）、芴酮（3d）和蒽醌（3e）的功能化碘乙酰胺进行位点特异性化学修饰，得到了一个小的化学修饰光酶（CMP）库（图1）。评估了这些初级光酶在吲哚1a的光环加成中的有效性，发现用硫杂蒽酮修饰的CMP-F93C-3c表现出最佳性能，其在405nm光照射下表现出优异的活性，以及极弱的背景反应干扰。然而，CMP-F93C-3c表现出极弱的对映选择性。作者对其进行了进一步的优化，对腔内不同位点的氨基酸进行诱变（图2），最终确定了一种有前途的突变体CMP-F93C-W96L-M8L-N88H-3c（CMP4.0），其具有卓越的活性和高对映选择性，并且具有良好的底物通用性。最后，CMP4.0在细胞裂解物以及大肠杆菌重组细胞中，被证明具有优异的对映选择性光催化活性（图3）。![]()
图1：（a）遗传编码光酶的强烈背景反应；（b）吲哚1a、硫杂蒽酮3c和光酶CMP-F93C-3c的紫外-可见光谱；（c）通过硫代-碘乙酰胺生物偶联化学构建含有不同光催化剂的初级CMP。
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图2：（a）腔内半胱氨酸的诱变位点以及对应催化性能；（b）CMP定向进化流程示意图。
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图3：（a）CMP4.0生成和光酶对映选择性[2+2]光环加成在全细胞中的示意图；（b）全细胞光生物催化的工作流程图。
结论：本文建立了开发人工光酶的化学偶联进化策略，其能够有针对性地掺入具有不同光物理性质的各种合成光催化剂。作者通过基于优化平台的多轮定向进化，将位点特异性蛋白质生物偶联与迭代诱变相结合，确定了具有多功能硫杂蒽酮光敏剂的最佳光酶变体CMP4.0。这种可见光光酶有效促进了2-甲酰胺吲哚的对映选择性[2+2]光环加成，并且，成功的全细胞光生物催化还展示了利用人工光酶设计非自然杂交代谢途径的潜力。参考文献：Yuzhou Wu et al. Chemogenetic Evolution of Diversified Photoenzymes for Enantioselective [2 + 2] Cycloadditions in Whole Cells. J. Am. Chem. Soc. 2024, DOI: 10.1021/jacs.4c03087.
