研究进展：光亲和标记（PAL）是一种重要的化学生物学技术，使科学家能够研究配体-蛋白质、脂质-蛋白质、DNA-蛋白质以及蛋白质-蛋白质的相互作用机制。它在药物研发中有着多种应用，如靶标识别，还可以实现更具战略性的先导化合物优化。PAL中最常用官能团为：双吖丙啶类（DAs）、叠氮苯类、二苯甲酮类和2-芳基-5-羧基四唑类。这些光激活模式都为探针开发提供了互补的机会，同时也存在由其固有反应性和大小的限制。例如，二苯甲酮很稳定，但它们的体积使其难在不破坏原始结合模式的情况下掺入配体结构中；2-芳基-5-羧基四唑对羧酸盐氨基酸具有选择性，但只能通过酰胺键偶联引入支架；芳基叠氮化物虽然具有混杂反应性，但需要高能光激活，这可能会破坏天然细胞环境；双吖丙啶类因其紧凑的形状和高反应活性受到研究人员青睐，在相关领域的应用最为广泛，但相对应的，它的热不稳定性使得它与后期多样化的苛刻反应条件不相容，阻碍了对其的长期储存。过去几十年，重氮化合物因其独特的反应性一直吸引着有机化学家，它们虽然不依赖于光活化本身，但其作为共价蛋白修饰剂已然受到广泛关注。然而，它们在水介质中的低预期寿命却限制了对蛋白质表面修饰的作用。解决方案：受到相关研究的启发，作者设计并合成了四类具有炔基手柄的恶二唑反应单元（OxaPAL），且分别含有羟基（1）、铵盐（2）、羧基（3）和甲磺酸基（4）连接点。OxaPAL 1可以通过与酰肼进行一锅-脱水反应，然后使用[双（乙酰氧基）碘]苯进行氧化环化来制备，其羟基部分可以直接用作连接点，也可以进一步衍生化为其余三个反应单元。随后，作者使用OxaPAL 1在已知的TMEM16A抑制剂上进行芳香取代，从而得到探针5。探针6为JQ1衍生物，是已知的溴域（BRD）和溴域蛋白（包括BRD2/3/4）的外端结构域（BET）家族的有效抑制剂，它是用多肽缩合试剂（HATU）作为激活剂和OxaPAL 2作为亲核试剂通过酰胺偶联得到的。探针7也通过了OxaPAL 2上的酰胺偶联，随后使用羟胺进行氨基裂解获得。除此之外，合成了几种激酶抑制剂探针—8和9（图1）。综上所述，合成路线的广度突出了恶二唑作为稳定重氮化合物前体的多功能性和热稳定性，可用于多种探针开发。![]()
图1：恶二唑多功能化探针的合成和衍生化。（红色显示已形成的键，黑色显示抑制剂支架，紫色显示恶二唑杂环）
为了进一步评估探针在水溶液中的反应性曲线（模拟蛋白质/小分子相互作用的弱结合事件），作者将探针6与O-甲基和N-保护的氨基酸（5 当量）在乙腈和磷酸盐缓冲盐水（PBS）1:1的混合物中孵育，使用HPLC-MS（高效液相色谱-质谱）对结果的分析表明，亲核氨基酸是唯一被OxaPAL类探针修饰的反应性氨基酸。赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的反应性最高，其次是半胱氨酸和酪氨酸（图2）。而双吖丙啶类仅选择性标记谷氨酸和天冬氨酸。![]()
图2：氨基酸与探针6在乙腈：PBS中暴露10 min后在312 nm光下的反应。
为了研究BRD抑制剂探针6是否能够在光存在下选择性地标记其靶蛋白，作者将探针6与重组BRD4-BD1以不同浓度孵育，然后暴露于312 nm 8 w透射仪10 min，然后使用Cy5荧光基团进行点击反应，并通过SDS-PAGE分析蛋白质。结果表明探针6能够以剂量依赖性方式标记BRD4-BD1。当在更有效的BET BRD抑制剂OTX-015存在下进行时，两种情况下的标记都消失了，表明恶二唑的存在不会改变分子的结合特性。且在没有光的情况下，探针没有与蛋白质形成共价键，验证了它能够作为光亲和标记的标签。作者还对重组布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）蛋白甚至膜蛋白TMEM16A进行了相同的研究，结果展示了恶二唑探针的多功能性（图3）。![]()
图3：探针5、6和8对TMEM16A、BRD4-BD1和BTK蛋白的凝胶荧光结合评估（黑色箭头显示了用于设计恶二唑化合物的出口向量）
作者将THP-1细胞分别加入二甲亚砜(DMSO)和1 μM的探针6溶液中，照射1小时，引发光交联后进行原位分析，收集细胞并处理以富集和表征探针修饰的蛋白质组，随后在细胞中进行了基于同量异位（串联质量标签）的定量化学-蛋白质组学分析实验，以揭示JQ1探针6蛋白质靶标，绘制了暴露于载体或探针6和紫外线激活后蛋白质丰度的log2比及其丰度p值，表明探针6能够与细胞中的BET BRD家族成员(BRD2/3/4)结合并富集2倍与DMSO。![]()
图4：在305 nm处用6进行原位富集。（A）已知的BRD4结合剂JQ1和探针6的结构。（B-D）在存在或不存在JQ1的情况下，THP细胞中富含6种蛋白质，如火山图所示。（灰色圆点表示合格的蛋白质命中；紫色图表示预期目标。）
结论：综上所述，作者以一锅、两步的方式从相应的酮中制备了含有恶二唑支架的反应单元，又可以进一步实现功能化。它们具有的的高稳定性甚至能使其在苛刻条件下进行后期改性，这是目前许多PAL技术无法实现的过程。肽图分析证实，在BRD4探针6的背景下，能用于在THP-1细胞中高效富集JQ1的已知靶标。这些结果对预期的结合位点具有选择性，证实了恶二唑啉支架是PAL探针设计的高效且稳定的标记物。用于大量可接近的化学试剂后期官能团化，将使我们能够到达使用目前已知PAL探针无法触及的空间。参考文献：Corentin Bon et al. Oxadiazolines as Photoreleasable Labels for Drug Target Identification. J. Am. Chem. Soc. 2024, DOI: 10.1021/jacs. 4c06936.
