研究进展：近年来，由于微生物抗生素的耐药性增加，研究人员对抗菌纳米材料的兴趣激增，推动了新的抗菌方法和尖端技术的发展。过去十年，一种有前途的替代的方法是微生物的光动力灭活（PDI）。光敏物质或光敏剂（PS）是PDI重要组成部分，其本身无害，但是暴露在特定波长下的光时会产生活性氧（ROS），这种剧毒的光生物种能通过破坏膜或使蛋白质和DNA降解导致细菌的活性迅速降低。光活性化合物的组合可以用于制造水消毒的先进材料，能在分子水平上能有效调节PS活性。但是在异质系统中，研究人员难以探究和理解决定材料活性的因素，结构与活性的关系仍是经验性的，这带来了巨大的挑战。目前，静电纺丝已成为制造先进材料的有效方法，制造抗菌纳米纤维的典型方法是将杀生物剂整合到纤维中，基于该策略，将PS加载到纳米纤维中可以创建由可见光驱动的无残留物抗菌材料，具有巨大潜力。从理论上讲，各种光谱技术均可以进行监测，包括瞬态吸收光谱，直接或间接监测三重态磷光，以及1O2的磷光，但是这些方法往往缺乏灵敏度，其技术复杂性使其在原位条件下难以实施。酞菁（Pcs）因其高消光系数、长吸收波长以及可调的光物理和光化学特性而被广泛用作光敏剂。除了一些可能提供新的和特定优势的合理设计外，PS聚集在PDI应用中通常是不利的，因为它会导致发射强度降低和ROS产生。因此，荧光发射被认为是确定体内局部药物浓度的有效指标，并且用于评估PS在光动力疗法中的疗效。荧光寿命，即荧光团保持激发态的持续时间，是一种与荧光团浓度无关的固有特性。与荧光强度不同，荧光寿命受测量技术的影响最小，能减小实验误差。荧光寿命成像显微镜（FLIM）已成功用于研究细胞中荧光团的局部环境，最近也用于研究聚合物制剂。解决方案：在该工作中，作者合成了两个对称的四取代酞菁：一个是疏水的苯氧基取代ZnPc-Ph（a），另一种是阳离子的N,N,N-三甲基胺苯氧基取代ZnPc-N+（c）（图1）。光动力作用的有效性与PS的光物理特性存在相关性，而本文中PS的光物理特征在很大程度上取决于所用的溶剂。作者通过测量不同DMF浓度下ZnPcs的寿命来关注激发态寿命的变化。结果表明，两种ZnPcs在DMF中的寿命衰减相对较长，Znpc-N+为2.69ns，Znpc-Ph为2.90ns。而在水中，亲水性ZnPc-N+表现出一致的稳定性，为2.68ns，不倾向于显著地聚集。疏水ZnPc-Ph则为0.24ns，表明其形成非荧光聚集体，随着DMF含量的增加，逐渐增加为2.90ns。使用9,10-蒽二基双（亚甲基）二甲酰（ADMA）作为1O2传感器，并且以寿命衰减测量相同的DMF:H2O溶剂比例检查其生成速率。对于ZnPc-Ph，在H2O中几乎无法检测到1O2形成。然而，在DMF：H2O比率为75：25和100：0的光照射后观察到1O2显著产生（图1b）。对于ZnPc-N+ 1O2，其在DMF和H2O的生成速率与衰变寿命相似（图1d）。![]()
图1：（a、c）两种ZnPcs在不同溶剂比例下的荧光寿命衰减曲线；（b、d）ADMA降解在红光照射下被ZnPc-Ph和ZnPc-N+光敏的一级图。
作者利用静电纺丝工艺从两种不同的聚合物制造膜—亲水性PAN和疏水性PCL膜，从中获得了八种不同的膜，具有不同的纤维直径（>500 nm和<500 nm），掺入疏水性ZnPc-Ph或亲水性ZnPc-N+作为光活性成分。结果表明，尽管使用的起始量相同，但是每个系统的PS的负载和包埋效率不同，在具有相反亲水性或疏水性的聚合物中，PS的较高负载量是由于分子间作用力、相行为和热力学的复杂相互作用引起的。接触角测试表明，所有基于PCL的膜都显示出相似的接触角，约为133°（图2）。该发现与报道的在静电纺丝PCL膜中观察到的接触角一致。与接触角小于90°的平面PCL薄膜相比，静电纺丝膜表现出明显更高的接触角（图2）。相比之下，基于PAN的膜表现出明显的亲水表面，其特征是接触角远低于40°。![]()
图2：水接触角测量图。
作者通过膜的紫外-可见漫反射光谱与紫外-可见光谱分析得出结论—PS的聚集态最可能是光降解的因素，使用荧光寿命成像显微镜（FLIM）原位研究纳米纤维内激发的PS物质的寿命，当亲水性聚合物用于疏水性PS时，纳米纤维中激发的PS的寿命较低，反之亦然，这表明微环境对PS的激发态特性有很大影响。作者通过拟合时间依赖性衰减，确定PAN中ZnPc-Ph的寿命为1.77 ns，而PCL中为2.03 ns， ZnPc-N+的平均寿命更长，为2.34 ns，对图像的详细分析显示，含ZnPc-N+的膜内存在高浓度的红点，表明界面处存在大量长寿命物质。随后，作者使用革兰氏阳性枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性大肠杆菌作为模型菌株，通过抗菌试验评估膜在消毒水中的有效性。与基于PAN的含有相同PS的系统相比，枯草芽孢杆菌更容易受到基于PCL的含有ZnPc-N+的膜的光动力灭活。虽然在纤维直径和灭活功效之间没有观察到明显的趋势，但结果表明，FLIM图像中大量长寿命的“活性位点”与PS的聚集态存明显相关性（图3）。这强调了PS的聚集状态和微环境在决定材料的整体活性方面所起的重要作用。大肠杆菌的灭活结果适中。![]()
图3：静电纺丝膜的FLIM图像和相应的荧光寿命分布（图像中每个像素的颜色编码值表示该像素中PS的强度加权平均寿命）。
为了理解含有ZnPc-N+的材料的基本抗菌机制，作者研究了作为PS的枯草芽孢杆菌细胞膜的完整性，用相应的膜照射后用绿色SYTO9和红色碘化丙啶（PI）的染料混合物孵育活/死荧光染色。从图4所示的荧光显微镜图像中可以明显看出，对照组中的细菌显示绿色荧光，表明存在活细菌。相比之下，在PCL1-ZnPc-N+和 PCL2-ZnPc-N+存在下受到光照射的细菌表现出主要的红色荧光，表明PI摄取以及细菌细胞膜受损。同样的，用PAN1-ZnPc-N+和PAN2-ZnPcN+薄膜处理并暴露在光线下的枯草芽孢杆菌也显示出高密度的死细胞，标记为红色。这些观察结果与生存测定的结果一致。![]()
图4：对照组枯草芽孢杆菌的荧光显微图像，用红光照射后与膜孵育细菌并用探针染色。
结论：综上所述，作者合成了亲水和疏水ZnPcs，并使用简单的静电纺丝技术成功将它们应用于PCL和PAN纳米纤维中，以获得具有光触发光动力抗菌活性的材料。采用各种分析技术来表征纤维和孔径、亲水和PS的聚集状态。结果表明，该膜促进革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌光动力灭活的能力，且受到所用聚合物和PS类型的显著影响。FLIM成像显示，含有亲水性ZnPc-N+的纳米纤维在水-材料界面处表现出大量长寿命的“活性位点”，并解释了这些材料的活性。这些发现证明了精确调整材料成分的重要性，并突出了FLIM成像在研究光活性材料结构和功能方面的潜力。参考文献：Anzhela Galstyan et al. Visualizing Active Sites in Electrospun Photoactive
Membranes via Fluorescence Lifetime Imaging. Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202414412.
