本文转载自：鱼头学习不迷茫
概要
研究急性髓细胞性白血病（AML）患者对CAR T细胞疗法的耐药性。通过一项初步试验，对12名复发或难治性AML成年患者使用自体抗CD123 CAR T细胞治疗。结果显示，成功制备CD123+细胞靶向的CAR T细胞的比例为90.4%，且10名患者（83.3%）出现了细胞因子释放综合征。临床响应率为25%。研究发现，治疗过程中释放的髓系支持细胞因子通过激酶信号通路支持AML白血病细胞的生存，导致CAR T细胞耗竭。这种由治疗诱发的细胞因子的促生存效应是AML中独特的耐药机制。研究提示，自体CAR T细胞制备在AML中是可行的，但治疗伴随高比例的细胞因子释放综合征和相对较低的临床疗效。结合CAR T细胞疗法与细胞因子信号抑制剂可能提高AML免疫治疗效果，实现更好的治疗结果。
疗效评价：第 28 天正式评估 ELN 反应的 6 个个体中，2 个达到分子完全反应（ 1 和 13），1 个达到MR阳性完全反应，CRi （5号）和 3 个SD 或PD（ 9、20 和 21）。3 个个体无法检测到骨髓形态和流式细胞术 MRD 的白血病负荷（完全缓解率 25%，90% 置信区间 （CI） 0.07-0.53）。ELN 反应个体的缓解持续时间为 84、126 和 381 天，输注 CART 123 的中位总生存期为 160 天（ 1d、f）。在最后一次随访中，有 2 人在接受 CART-123 失败 （ 20号） 或 CART-123 后复发 （13号） 的后续治疗后存活。2 人死于 CART 相关毒性（12 和 16），1 人在进行性 AML 进行同种异体造血干细胞移植后死于移植物抗宿主病 （GVHD）（参与者 2），7 人死于进行性 AML。
安全性：共发生 49 例严重不良事件，3 例脓毒症事件、5 例实验室异常、3 例低血压事件和 6 例呼吸性并发症（1b）。共有 87 例不良事件被认为与研究程序有关。检测到了以前与 CAR T 细胞活性无关的血清因子的统计学显着增加，例如吲哚胺 2,3-双加氧酶 1 （IDO1） 和 IL-3（ 1g ）。
那有CRS证明有反应。为什么还会效果不好且副作用又大呢？
在从试验参与者那里获得的血清中孵育原发性 AML 原始细胞，并测量他们的生存率。发现，在 LD 前从个体获得的血清（“基线血清”）在无血清培养基的背景之上不支持 AML 存活率，而从 CART-123 扩增峰值（“峰值血清”）的匹配个体获得的血清显著增加了 AML 活力（ 2a）。为了确定介导这种作用的候选血清因子，我们将原发性 AML 原始细胞与在我们的患者中检测到的个体重组人细胞因子一起孵育，并测量它们对 AML 活力的影响。发现，与 CART 细胞疗法相关的细胞因子（如 IL-6、IFNγ 或 G-CSF）不会影响 AML 存活率，而 IL-3、GM-CSF 和 FLT3L 通过减少细胞凋亡显着增加 AML 活力（ 2b-f ）。暴露于细胞因子后原始细胞存活率的提高并不伴随着原始细胞的骨髓分化或 CD123 表达的变化，这与我们的临床观察一致，即 CD123 表面表达在治疗期间保持稳定。测试的细胞因子均未改善培养物中原代 B-ALL 样品的活力（2b-f ），这与 CART-19 研究的早期观察一致，即 CRS 在不影响 CAR T 细胞功效的情况下导致毒性。
接下来看原始细胞暴露于候选细胞因子是否可以介导 AML 对 CAR T 细胞的耐药性。由于细胞因子可以在 CAR T 细胞扩增之前以及 CRS 期间释放，因此我们模拟了瞬时和连续暴露于这些因素（ 2g）。
短暂暴露于 GM-CSF、FLT3L 或 IL-3 使 AML 能够在治疗相关、低E：T比抵抗 CART-123 的杀伤（ 2h-j ）。在 CAR T 细胞扩增高峰期收集的试验患者血清，也产生了对 CART-123 的 AML 耐药性（2k）。在引入 CART-123 之前洗掉细胞因子或血清，AML 对 CART-123 的耐药性仍然存在（ 2k ）。细胞因子介导的 AML 抵抗并不是 CART-123 独有的，因为细胞因子还促进了 AML 原始细胞上靶向 CD33 分子的 CART 细胞的 AML 抵抗。CART-123 细胞不会受到测试细胞因子的直接损害。GM-CSF、FLT3L 和 IL-3 促进 AML（但不是 B-ALL）存活和对 CART 细胞杀伤的抵抗性的研究结果与它们在骨髓生物学中的作用一致，并得到同源受体的谱系特异性表达的支持。总之，免疫治疗过程中分泌的骨髓支持细胞因子赋予原发性 AML 原始细胞对 CAR T 细胞的相对耐药性。
在确定骨髓支持细胞因子提高 AML 存活率后，我们假设随之而来的抗原持久性将导致 CART 细胞耗竭和功能障碍。为了测试这一点，将 CART-123 暴露于细胞因子引发的 AML （CPA） 或未引发的 AML （UPA） 中 2 周，并测量了与 T 细胞耗竭相关的表型和功能标志物的表达。流式细胞术数据的 FlowSOM 聚类显示，CPA 和 UPA CART-123 细胞明显地聚集在彼此身上其他（3a ）。T 细胞的这种聚集还表明 CPA CART-123 细胞与耗竭的 T 细胞表型广泛重叠，而另一方面，UPA CART-123 细胞与祖细胞耗竭的 T 细胞表型簇重叠（ 3a、b）。T 细胞簇的定量证实，CPA CART-123 细胞更频繁地与终末或 KLR 样耗竭表型相关（3c）。
CPA：cytokine-primed AML；UPA：unprimed AML。; ext KLR, KLR-like exhausted; exh term, terminally exhausted; exh, exhausted.
为了支持这一点，将单个参数投影到UMAP 拓扑上表明，单个表面抑制受体（包括 CD39、NKG2A、CD94、CTLA4、LAG3 和 TIM3）的表达在 CPA CART-123 细胞上较高（3d ）。CPA CART-123 细胞比 UPA CART-123 更有可能同时表达多个表面抑制配体（ 3e ）。此外，定义干细胞样耗竭祖细胞状态的转录因子 TCF-1 在 CPA CART-123 细胞中减少。总之，暴露于细胞因子支持的 AML 的 CART-123 细胞获得了更耗竭的表型（3b，c）。进一步测试了体外暴露于 CAR 依赖性或 CAR 非依赖性刺激后的 CART-123 功能耗竭。作为对这两种类型的刺激的响应，CPA CART-123 细胞在 2 周内产生的 IL-2 较少，这与它们更耗竭的表型一致（3f）37。3 周后，CPA CART-123 细胞中 IFNγ 和肿瘤坏死因子 （TNF） 的产生减少，与已知的这些细胞因子的后期减少一致。
虽然单独持续抗原暴露可导致 T 细胞清除，但调查细胞因子是否通过增加 AML 原始细胞上的抑制性配体表达来额外影响 CART-123 耗竭，并且评估了 UPA 或 CPA 共培养的 CD80 和 PD-L1 表达以及 CTLA4 和 PD-1 的配体分别。我们发现这些标志物在 AML 细胞上的表面表达没有变化，表明细胞因子增强的 AML 存活和无法清除靶抗原是该模型中 CART-123 耗竭的原因。为了在临床队列中验证这些发现，检查了输注后至少一周进行的骨髓抽吸物的单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq）。与细胞培养模型一致，我们在患者 T 细胞中发现了 CAR123 转录本、骨髓支持细胞因子和许多抑制性受体的重叠表达。我们还从先前的 T 和 CAR T 细胞耗竭研究中得出了一个基于 scRNA-seq 的耗竭评分，并将这些评分专门应用于从输注后至少 2 周收集的患者骨髓抽吸物中回收的表达 CART-123 的细胞。表达 CART-123 的细胞从无反应者的 骨髓中恢复的耗竭评分高于有反应者的 CART-123 细胞（ 3g）。这些结果表明，输注后，移植的 CART-123 细胞分泌髓作用细胞因子，促进 AML 存活并最终耗尽。
接下来研究髓作用细胞因子如何支持 AML 原始细胞存活。通过 RNA 测序评估了培养物中原发性 AML 原始细胞中短暂 GM-CSF 细胞因子暴露的转录后果。上调途径的过度表达分析显示，在细胞因子刺激的 AML 原始细胞中，信号转导的转录特征富集。然后，从 LD 前和 CART-123 扩增高峰期的试验参与者那里获得的系列骨髓样本的 scRNA-seq 数据。使用 PathfindR 通路分析将 CART-123 扩增峰值时收集的样本与其配对的基线、LD 前化疗样本进行比较。该分析揭示了 AML 中 CART-123 扩增峰值时信号通路的激活（ 4a）。许多细胞因子，包括 IL-3、FLT3L 和 GM-CSF，通过 JAK 特别是通过 STAT3/STAT5 发出信号。
为了验证 JAK/STAT 信号转导在 AML 中对研究的作用，将原发性 AML 原始细胞暴露于来自临床试验参与者的配对“基线”或“峰值”血清，并测量候选 STAT pro tein 磷酸化。分析显示，与基线血清或 PBS 对照相比，暴露于峰值血清后，磷酸化 STAT5（Tyr 694 位）和磷酸化 STAT3（Tyr 705 位）显著增加（ 4b ）。单个细胞因子（如 GM-CSF）处理也显示 pSTAT5 和 pSTAT3 水平升高。相比之下，IL-6 是一种不增强 AML 存活率的细胞因子，适度刺激 pSTAT3，但不会导致 pSTAT5 增加，这表明 STAT5 磷酸化可能与 AML 存活信号转导更紧密相关。磷酸化 STAT5 已被证明是细胞因子的关键介质，通过增加抗凋亡介质（如 BCL2 或 BCL-XL）来促进对常规治疗药物的 AML 耐药性。与这些结果一致，与 GM-CSF 一起孵育的原代 AML 原始细胞的蛋白质印迹分析显示 BCL2 蛋白水平增加（ 4c）。总之，这些数据表明通过 JAK/STAT5 的细胞因子信号转导有助于减少 AML 细胞死亡，从而减少 CAR T 细胞对 AML 细胞的杀伤。
JAK/STAT 信号可通过临床使用的小分子（如 JAK1/2 抑制剂 ruxolitinib）进行抑制。这些抑制剂可用于阻断由细胞因子暴露引发的信号级联反应，从而恢复 AML 对 CART-123 的敏感性。我们首先证实 ruxolitinib 可以通过磷酸流式细胞术阻断细胞因子诱导的 STAT5 磷酸化（ 4d）。接下来研究这是否转化为防止细胞因子暴露的抗凋亡作用。事实上，在 AML 原始细胞中加入 ruxolitinib 足以逆转 GM-CSF 赋予培养物中 AML 原始细胞的生存优势。重要的是，这种效果是在不减少未暴露于细胞因子的活 AML 细胞数量的情况下实现的。最后，测试了添加 ruxolitinib 是否可以阻断 AML 原始细胞中细胞因子介导的 CART-123 耐药。发现 ruxolitinib 逆转了细胞因子暴露的影响并恢复了 CART-123 效力。在 E：T 比率（ 4e）和不同的 AML 和 CART-123 供体（ 4f）中观察到这种益处。还测试了是否可以用 BH3 模拟物维奈托克逆转由 BCL2 水平升高引起的抑制 AML 细胞凋亡，该分子与 CART-123 联合使用也可有效恢复 AML 的杀伤。
讨论：
活化的 T 细胞分泌细胞因子作为其效应分子的一部分。虽然通常被认为是 CAR T 细胞生物活性的指标，但 CRS 的发生率和严重程度不一定与 CAR T 细胞结局的改善相关。
据了解，驱动 CRS 的细胞因子来源于多种细胞，包括 CAR T 细胞和宿主中的许多其他细胞类型。常规化疗，包括 LD 化疗，也会诱导反应性细胞因子。最近的一项研究表明，用于实体瘤免疫治疗的 LD 化疗触发的细胞因子（包括 IL-6 和 GM-CSF）的产生可导致过继性 T 细胞功能障碍。
可以通过 ruxolitinib 的 JAK1/2 抑制阻断细胞因子信号传导来逆转细胞因子介导的对 CAR T 细胞疗法的耐药性。
细胞因子刺激的 AML 可以被 CART 细胞以高效应子与靶标比率杀死，但在活动性疾病的情况下，不太可能具有生理相关性，并且在人类中实现这些可能带来制造挑战和高毒性率。通过确定 AML 细胞通过利用细胞疗法本身产生的刺激来达到这种死亡缺陷治疗耐药状态的机制来扩展这些发现。通过这种方式，AML 利用了基于免疫的疗法独有的漏洞。
骨髓支持细胞因子（如 GM-CSF）已被研究作为辅助疗法，以促进常规 AML 化疗后细胞计数更快恢复。但在一些临床试验中，GM-CSF 与 AML 复发率增加和总生存期变差有关。据报道，GM-CSF 的基线循环水平与 AML 治疗反应呈负相关。
因样本量有限，因此不保证完全正确。
参考文献：https://doi.org/10.1038/s41591-024-03271-5
做点儿补充：
AML 中 CAR T 细胞疗法与高 CRS 发生率和相对较差的临床疗效相关联，主要原因如下：
1. CRS 的发生机制：
CAR T 细胞的激活：CAR T 细胞识别并杀死 AML 细胞时，会释放大量细胞因子，包括 IL-6、IFNγ 等，导致 CRS 的发生。
骨髓微环境的免疫抑制：AML 患者的骨髓微环境存在明显的免疫抑制，例如表达免疫抑制因子（如 TGF-β、IDO 等）的细胞增多，阻碍 CAR T 细胞的活化和增殖，导致 CRS 持续时间延长，程度加重。
AML 细胞的特性：AML 细胞可能表达更高水平的细胞因子受体，对细胞因子的刺激更为敏感，从而导致更严重的 CRS。
2. 相对较差的临床疗效：
AML 细胞的耐药性：AML 细胞更容易出现耐药性，例如抗原逃逸、细胞因子依赖性生存等，导致 CAR T 细胞治疗失败。
CAR T 细胞的衰竭：AML 细胞表达的细胞因子会刺激 CAR T 细胞产生抑制性受体，导致 CAR T 细胞功能衰竭，无法有效杀死 AML 细胞。
骨髓微环境的免疫抑制：AML 患者的骨髓微环境存在明显的免疫抑制，不利于 CAR T 细胞的活化和增殖，降低 CAR T 细胞治疗的疗效。
通过这篇文章还看到了点儿啥信息：
这项研究发现，AML 患者自体 CAR T 细胞制造是可行的，但治疗过程中存在一些挑战：
1. 自体 CAR T 细胞制造的成功率：
研究中，90.4% 的细胞培养批次成功制备出靶向 CD123 的 CAR T 细胞，表明自体 CAR T 细胞制造技术在 AML 中是可行的。
2. 高 CRS 发生率：
83.3% 的患者在接受 CAR T 细胞输注后出现了 CRS，其中 3 人出现了严重的 CRS，并导致死亡。
这表明 CAR T 细胞治疗 AML 仍存在一定的安全性风险，需要更加谨慎地选择患者并进行密切的监测。
3. 相对较差的临床疗效：
只有 25% 的患者达到临床反应，且大多数反应持续时间较短，说明 CAR T 细胞治疗 AML 的疗效仍有待提高。
这需要进一步优化 CAR T 细胞的设计和治疗方案，以提高其疗效。
这些发现对 AML 治疗的影响：
提高安全性：需要开发新的方法来降低 CRS 的发生率和严重程度，例如使用更安全的 CAR 结构、优化 CAR T 细胞的制备工艺、联合使用免疫调节剂等。
提高疗效：需要开发新型 CAR 结构，例如双靶点 CAR T 细胞，以减少抗原逃逸的发生。同时，需要探索 CAR T 细胞与其他治疗方法，例如化疗、靶向治疗、免疫调节剂等联合应用，以提高疗效。
优化患者选择：需要进一步研究 AML 患者的生物学特性，以筛选出更适合 CAR T 细胞治疗的患者群体。
探索新的治疗策略：例如，探索靶向 AML 干细胞的治疗方法，或开发新型免疫治疗药物，以提高 AML 的治疗效果。
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