北京协和医院肿瘤内科由婷婷、赵林、白春梅、孙昭，中国医学科学院基础研究所韩钦、赵春华等2023年11月发表于Aging and Disease（IF=7.4）杂志上的论著：POSTN Secretion by Extracellular Matrix Cancer Associated Fibroblasts (eCAFs) Correlates with Poor ICB Response via Macrophage Chemotaxis Activation of Akt Signaling Pathway in Gastric Cancer
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研究背景
免疫检查点阻断剂（Immune checkpoint blockade，ICB）的出现为多种实体肿瘤的治疗提供了新的思路。晚期胃癌患者对ICB的应答有限，而肿瘤免疫微环境（tumour immune microenvironment，TME）被认为是ICB耐药性的重要原因之一。肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）作为TME中最为丰富的细胞类型，具有高度的异质性。目前研究表明，CAFs能够影响TME中的免疫细胞浸润、肿瘤内迁移、CD8+ T细胞耗竭、巨噬细胞极化等多个方面。既往的胃癌单细胞转录组测序研究可将成纤维细胞群分为四个亚群，其中与细胞外基质相关的CAFs亚群（extracellular-matrix，eCAFs）与巨噬细胞的关系尤为密切。目前研究认为TME中肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）与ICB应答呈显著的负相关性。故我们推测eCAFs可能通过影响巨噬细胞，从而影响胃癌患者的ICB疗效。
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研究方法
首先在胃癌患者组织标本中鉴定eCAFs存在。随后在TCGA数据库和真实世界接受免疫治疗的胃癌患者中，评估eCAFs和ICB疗效的相关性。后续基于TCGA数据库进行eCAFs相关的免疫浸润分析，并选取95例胃癌手术标本探究eCAFs与巨噬细胞的关系。体外构建eCAFs模型后，将POSTN基因进行过表达及敲低，以探究eCAFs中POSTN的表达水平对巨噬细胞的趋化作用及信号通路的影响。在裸鼠胃癌皮下移植模型中，验证干扰POSTN对巨噬细胞趋化的影响。最后，在TCGA数据库和多种类型实体瘤患者的组织标本中探索eCAFs与ICB疗效的关系。
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研究结果
首先，我们对我院胃癌患者的组织标本进行POSTN和FAP的免疫荧光双染，结合既往单细胞测序研究，我们在真实世界中证实了胃癌组织中POSTN+FAP+ 的eCAFs亚群的存在（图1A）。同时结合TCGA数据库和真实世界胃癌患者，我们发现POSTN+FAP+的eCAFs亚群可能与胃癌免疫治疗无应答显著相关（图1B-G）。
图1. POSTN+FAP+的eCAFs与胃癌ICB疗效较差相关
基于TCGA-STAD数据库中，我们发现POSTN（图2A）、FAP（图2B）的表达水平与胃癌中巨噬细胞的免疫浸润显著相关。同时POSTN（图2C）、FAP（图2D）均与M2型巨噬细胞的标志物—CD163的表达水平呈显著正相关。在胃癌患者的组织标本中得到了与TCGA-STAD数据库一致的结论（图2E），故我们认为在胃癌的肿瘤免疫微环境中eCAFs与巨噬细胞的免疫浸润密切相关。
图2. 在公共数据库与真实世界组织标本中证实eCAFs与巨噬细胞关系密切
我们分别从两种人胃癌细胞系——AGS和GC803的上清液中提取出胃癌细胞的外泌体。通过电镜形态、粒径大小及相关蛋白标记物对外泌体进行验证（图3A-F）。随后应用AGS、GC803的外泌体在体外诱导hMSCs成为eCAFs，分别于0、1、3、5、7天提取RNA和蛋白。结果发现，随着AGS的外泌体在体外诱导的天数增加，POSTN、FAP的表达水平呈逐渐上调趋势（图3G-L）。因hCAFs的可及性低、体外增殖能力有限，故本研究后续实验选择外泌体诱导的eCAFs模型，模拟eCAFs完成体外的功能分析。
图3. 利用两种胃癌细胞系外泌体体外诱导eCAFs模型
随后通过transwell体系研究对巨噬细胞趋化能力的差异。与hMSCs相比，CAFs和hCAFs能够显著促进巨噬细胞的趋化能力，且外泌体诱导7d的CAFs和hCAFs对巨噬细胞的趋化能力无显著的差异（图4）。
图4. eCAFs和hCAFs可显著促进巨噬细胞的趋化
进一步对比过表达及敲低POSTN的CAFs对巨噬细胞的趋化作用。与对照组的CAFs比较，过表达POSTN的CAFs对巨噬细胞的趋化作用显著提高（图5A-B）。反之，敲低POSTN的CAFs对巨噬细胞的趋化作用则明显下降（图5C-D）。GC803外泌体诱导的CAFs得到了类似的结果。体内实验利用NC-MSCs和si-POSTN-MSCs分别与GC803细胞混合构建胃癌裸鼠成瘤模型。结果发现敲低POSTN组的巨噬细胞标志物—F4/80（图5G）的阳性率显著低于对照组。而M2型巨噬细胞的标志物—CD163的阳性率也得到了相似的结论（图5I）。故在体内实验再次验证胃癌中POSTN的表达水平与巨噬细胞浸润呈显著的正相关。
图5. POSTN是eCAFs促进巨噬细胞趋化的关键分子
既往文献报道，POSTN与整合素αvβ3为配受体关系。我们猜测在胃癌中POSTN可能同样通过与巨噬细胞的整合素αvβ3结合，从而激活巨噬细胞内Akt的磷酸化，促进巨噬细胞的趋化。过表达POSTN-CAFs的条件培养基处理30min、1h、3h时，巨噬细胞中磷酸化Akt显著上调（图6A-B），敲低POSTN得到了相同的趋势（图6C-D）。Rescue实验结果显示，在抑制巨噬细胞内Akt后，过表达POSTN的CAFs对巨噬细胞的趋化作用显著减弱。上述结果证实磷酸化Akt为过表达POSTN的CAFs促进巨噬细胞趋化的关键蛋白（图6E）。
图6. eCAFs分泌的POSTN通过磷酸化的Akt信号通路促进TAMs趋化
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结论
在胃癌的肿瘤微环境中，eCAFs通过分泌POSTN激活巨噬细胞内Akt蛋白的磷酸化，促进巨噬细胞的趋化。胃癌及多种类型实体瘤组织中POSTN的高表达可能提示ICB疗效欠佳。POSTN有望成为提高ICB疗效的潜在联合治疗靶点。
★ 作者介绍 ★
第一作者 由婷婷
北京协和医院2023级内科临床型博士后，师从白春梅教授
共同通讯作者 赵林
北京协和医院肿瘤内科副主任，主任医师，医学博士，教授，硕士生导师。
共同通讯作者 白春梅
北京协和医院肿瘤内科主任医师，教授，博士生导师。
共同通讯作者 韩钦
中国医学科学院基础医学研究所 细胞生物学系研究员，博士生导师，“重大新药创制”国家科技重大专项项目首席科学家。
共同通讯作者 孙昭
北京协和医院肿瘤内科助理研究员
共同通讯作者 赵春华
医学博士、博士生导师。长江学者特聘教授、国家杰出青年科学基金获得者、国家新世纪百千万人才工程国家级人选、卫生部有突出贡献中青年专家。
作者 由婷婷 赵林 白春梅 韩钦 孙昭 赵春华
编辑 惠敏 李蓉真
策划&审核 孙雪峰
执行主编 葛郁平
主编 李雪梅 康红
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