随着养殖业的发展,各种由细菌所引发的疾病也日益增多，对养殖业的健康发展带来重大影响。
越来越多的研究表明,应用益生菌可以在一定程度上减少抗生素的使用。
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是革兰染色呈阳性的一种球菌,能够定植于宿主肠道内表面,其次级代谢产物中含有有机酸、过氧化氢和胞外多糖等多种抑制细菌生长的物质，可抑制多种致病细菌的生长和繁殖,在宿主肠道黏膜具有较高的黏附能力。
棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)发酵性能优良，并伴有有机酸的生成,可有效降低机体消化道内 pH,改变致病微生物生长环境,在食品、医药和农业等领域具有巨大的应用潜力。
益生菌作为抗生素的潜在替代品.在改善渔业产品的生长繁殖性能和抗病性方面发挥着重要作用。
鲫鱼作为我国食用鱼的主要品种之一，以其独有的风味受到人们的青睐。
随着渔业的蓬勃发展，鲫鱼养殖的规模也在逐步壮大，如今年产量已突破200万吨,在淡水养殖业中具有重要地位。
目前,鲫鱼养殖中出现的各种疾病已经严重危害水产养殖业的发展。
鲫鱼的非特异性免疫是其抵抗病原微生物感染的有效途径。
γ干扰素(IFN-γ）具有抵御病毒入侵、调节免疫能力及防止肿瘤发生等特性;
白介素 1β(IL-1β)能够使血小板受到相应刺激，从而促使生长因子的产生,能够调节细胞自身的生长与细胞的分化；
肿瘤坏死因子(TNF-α)由单核细胞、NK细胞等多种免疫细胞分泌而产生,在细胞间起信号传导的重要作用,在抵抗细菌和病毒入侵机体的过程中充当重要的介质，TNF-α在胚胎发育等方面也发挥着重要作用。
本研究通过对鲫鱼饲喂粪肠球菌和棒状乳杆菌,对比分析鲫鱼各脏器中IFN-γ、IL-lβ、IL-10和TINF-α 的基因表达含量对鲫鱼抗病性的影响，为益生菌在鲫鱼免疫中的应用提供理论基础。
材料与方法
1.1试验菌株
吉林农业大学动物医学院预防兽医学实验室分离纯化得到的鲢鱼源粪肠球菌 B-8(MTO71637)武昌鱼源棒状乳杆菌 W-17(MT071571)以及嗜水气单胞菌TPS保存于吉林农业大学动物科学技术学院实验室。
1.2 试验动物
140 尾健康鲫鱼购自长春某水产养殖基地，平均体质量(30.0±1.0) g,养殖于水温(27.0±0.5)℃的鱼缸中，空腹饲养10 d并进行观察。
1.3 添加乳酸菌鱼粮的制备
将纯化的粪肠球菌B-8 和棒状乳杆菌 W-17分别于 200 mL的 MRS液体培养基中培养 24 h，将乳酸菌培养液离心后，弃掉上清液并保留菌体沉淀，使用PBS缓冲液洗菌3次，将粪肠球菌B-8 和棒状乳杆菌W-17浓度调至 1x10的8次方 CFU/mL。
将菌液与基础鱼粮充分混匀.平铺于37℃温箱中晾干后再置于4℃环境中冷藏备用。
1.4 鲫鱼饲养试验
140 尾健康鲫鱼暂养 10 d。鲫鱼分别灌服lx10的9次方CFU/mL的粪肠球菌 B-8 和棒状乳杆菌W-17,观察无死亡现象,脏器无明显病变(n=10)。
将初始体质量为(30.0±1.0)g的鲫鱼分为对照组粪肠球菌B-8组及棒状乳杆菌 W-17组每组40 尾3 次重复。
同时供应充足的氧气,水温(27.0±0.5)℃饲喂试验中,pH始终保持在(7.59±0.05)。
每天以鲫鱼体质量2%的鱼粮饲喂2次,持续4周。
1.5鱼免疫指标检测
1.5.1 血清采集
在饲喂后0,7,14,21,28 d时,每组随机抽样取3 尾试验鲫鱼。
使用MS-222对鲫鱼进行麻醉后，在鲫鱼尾部进行静脉采血,将采集的鲫鱼血液置于温箱中静置 1h,随后放人细菌柜中 12 h,血清成功析出后离心,将上清液置于-80℃环境中保存。
1.5.2 检测方法
严格按照 ELISA 试剂盒所提供的操作流程进行规范操作,根据所测得的 OD450nm值进行标准曲线的绘制。
1.6 鱼组织RNA提取
分别取试验组和对照组鲫鱼在饲喂后 0.7.14.21.28 d的心脏、肝脏、脾脏、肾脏和中后段肠道样本,置于液氮中进行充分研磨,严格按照 Bio-Flux RNA 提取试剂盒的提取方法进行操作，测定提取的各组织 RNA 浓度，并进行电泳试验，保存在超低温冰箱内。
1.7 保护率试验
饲喂免疫鲫鱼4周后进行保护率试验。将半数致死量为 1x10的6次方 CFU/mL的嗜水气单胞菌过夜培养，将菌液离心后保留菌体沉淀并使用PBS 洗菌3 次，将菌液浓度调至 5x10的6次方 CFU/mL，每尾鲫鱼腹腔注射 200 μL菌液，观察 14 d并记录鲫鱼状况。
2结果与分析
2.1 ELISA检测结果
2.1.1 IL-lβ检测结果
粪肠球菌B-8组在免疫后21 d时,IL-lβ活性水平达到峰值(145.593 2ng/L),28 d时降至136.355 9 ng/L;棒状乳杆菌 W-17组在免疫过程中 I-lβ 活性水平处于平稳状态，无明显上升趋势；
2个乳酸菌组 IL-1β活性与对照组差异显著(P<0.05.图1)。
2.1.2 TNF-α 检测结果
在免疫后14 d时，粪肠球菌 B-8 组TNF-α 活性水平达到最高值(117.228 9 ng/L),显著高于棒状乳杆菌 W-17 组和对照组，随后出现下降趋势；
在28 d时，活性水平降至72.650 6 ng/L;棒状乳杆菌 W-17 组在免疫21d时TNF-α 活性水平达到最高值(64.819 2 ng/L)，与对照组差异显著(P<0.05),随后活性稍有下降(图2)。
2.1.3 IL-10检测结果
粪肠球菌 B-8组和棒状乳杆菌 W-17在免疫后 14 d时差异不显著，但粪肠球菌 B-8组在免疫后 21d时,L-10活性达到121.456 3 ng/L,显著高于棒状乳杆菌 W-17 组和对照组,在28 d时降至 107.776 7 ng/L,活性稍有回落(图3)。
2.1.4 IFN-γ检测结果
粪肠球菌 B-8 组的鲫鱼在免疫后7d时产生了IFN-γ,在 14 d时达到227.261 9 ng/L,与对照组相比差异极显著(P<0.01).在21 d时活性水平下降至 179.642 9 ng/L,随后处于平稳状态。
棒状乳杆菌 W-17 组在免疫后 14 d时,IFN-γ活性达到最大值,与对照组相比差异显著，且粪肠球菌 B-8 组的IFN-γ活性水平高于棒状乳杆菌 W-17 组(图4)。
2.1.5 IgM 检测结果
饲喂粪肠球菌 B-8 组鲫鱼血清中 IgM 水平高于对照组和棒状乳杆菌W-17组。
在免疫后21 d时,粪肠球菌 B-8组IgM活性水平达到峰值(5.155 mg/L),与其他试验组比较差异极显著(P<0.01);
随后IgM 活性水平稍有回落,在 28 d时回落至 4.86 mg/L;在整个免疫过程中,IgM 活性水平始终高于其他试验组；棒状乳杆菌 W-17 组与对照组相比差异不显著(图5)。
2.2 RT-PCR检测结果
2.2.1 IL-1β基因表达量检测
饲喂粪肠球菌B-8组和饲喂棒状乳杆菌 W-17组的鲫鱼各组织器官中的 IL-1β基因表达量与对照组相比明显升高，差异极显著。
各试验组与对照组相比在免疫后 7 d时,各器官中IL-1β基因表达量开始提升，到 28 d时达到最高值，免疫过程中粪肠球菌 B-8组 IL-1β基因表达量是上升趋势，且明显高于棒状乳杆菌 W-17组(图 6)。
2.2.2 TINF-α基因表达量检测
粪肠球菌 B-8组的各组织在免疫 7d后，TINF-α 基因表达量开始上升,免疫过程中与对照组相比差异极显著。
棒状乳杆菌 W-17组的各组织器官在免疫后 7 d基因表达量开始呈现上升趋势,在免疫 28 d达到顶峰,其中心脏组在免疫 21 d达到顶峰,随后保持稳定，各组织器官 TNF-α基因表达量均低于类肠球菌B-8组(图7)
2.2.3 IL-10基因表达量检测
粪肠球菌 B-8组在各器官中自免疫后7 d时,IL-10基因表达水平开始逐渐上升,其中心脏、脾脏、肠道在免疫后28 d时,IL-10 基因表达水平达到最大值,与对照组相比差异极显著，且基因表达量显著高于棒状乳杆菌 W-17组。
棒状乳杆菌 W-17 组在各组器官中IL-10 基因表达水平虽呈现上升趋势,但在免疫周期中始终低于粪肠球菌 B-8组 IL-10 基因表达量(图 8)。
2.2.4 IFN-γ基因表达量检测
粪肠球菌 B-8在肝脏组免疫后7 d时,IFN-γ基因表达量开始快速提升，显著高于棒状乳杆菌 W-17组和对照组在免疫后 28 d时达到最高值；
在脾脏、肾脏和肠中IFN-γ基因表达量在免疫后 14 d时,开始高于棒状乳杆菌 W-17 组。
棒状乳杆菌 W-17 组在免疫后 21 d时,心脏、肝脏、脾脏中IFN-γ基因表达量达到最大值,在免疫后 28 d时基因表达水平略有回落,粪肠球菌 B-8 组的IFN-γ基因表达量高于棒状乳杆菌 W-17组(图9)。
2.3 攻毒保护率试验结果
对照组(PBS组)鲫鱼在1周内全部死亡，粪肠球菌 B-8组和棒状乳杆菌 W-17组饲喂的鱼在 14 d内部分死亡,试验结果见图 10。
粪肠球菌B-8组相对保护率为 60%；棒状乳杆菌 W-17组相对保护率为 40%。
结果表明:在鱼粮中添加粪肠球菌 B-8 和棒状乳杆菌 W-17 均可以有效增加鱼攻毒后的存活率，日饲喂粪肠球菌 B-8 组的鱼存活率更高。
3讨 论
近年来，多种益生菌已在水产养殖业中得到广泛应用。
益生菌进入机体后会在肠道黏膜内表面进行黏附与定植,进而改变肠道内环境,促进细胞因子表达,进而提升机体免疫力。
本试验应用鱼源粪肠球菌 B-8 及棒状乳杆菌 W-17 包被鱼粮，采用饲喂的方式免疫鲫鱼，检测鱼类常见非特异性免疫指标基因表达量；
结果表明 2株乳酸菌均能引起鲫鱼的免疫反应。
硬骨鱼类特异性IgM抗体能够使补体作用于红细胞与特异性抗原反应,还可以中和或杀灭细菌性病原体，同时也被证实还可以介导抗原特异性的调理作用，包括益生菌在内的多种免疫调节剂可以对水生生物 IgM 的表达产生影响。
本试验中,与其他试验组相比,使用粪肠球菌B-8口服免疫的鲫鱼血清中 IgM 含量最高，表明饲喂粪肠球菌 B-8 的鱼通过诱导体液免疫会使免疫球蛋白水平得到一定程度的提升。
IL-1β作为机体内的促炎因子,可以通过促进其他细胞因子的表达而达到调节机体免疫的作用。
IL-1β作为前炎症因子在机体受到病原入侵时快速表达，从而刺激了 TNF-α 的表达。
试验组中通过给鲫鱼口服补充乳酸菌,使鲫鱼血清中和各脏器中的IL-1β 和TNF-α表达水平与对照组相比均升高且饲喂粪肠球菌B-8组基因表达水平明显高于棒状乳杆菌 W-17 组。
这可能是由于乳酸菌进入宿主肠道后,改变了免疫细胞、肠上皮细胞与微生物之间的内环境稳态平衡,这可能会引起一些免疫细胞对益生菌的识别摄取,进而导致机体炎症反应,引起了细胞因子分泌量升高。
有研究表明,在鲤鱼饲料中添加益生菌代谢产物可以有效上调机体细胞因子表达量,提升机体免疫反应,这一结果与本试验相似。
IL-10 是一种抗炎细胞因子,可与 TGF-β1共同参与免疫反应对机体产生免疫刺激作用。
本试验中乳酸菌组相比于对照组,均能够在鲫鱼组织器官中刺激IL-10 细胞因子的表达,从而使机体免疫反应得到一定程度的加强，其中饲喂粪肠球菌 B-8 可以提高IL-10细胞因子的表达量。
试验结果表明,补充粪肠球菌B-8的鱼免疫作用相对较好。
IFN-γ具有高病毒抵抗性、高感染抵抗性。
本试验结果显示,通过给鲫鱼口服粪肠球菌 B-8 可以提升血清中以及各组织器官中IFN-γ基因的表达量，使鲫鱼机体产生较高水平的IFN-γ,由此可以推断出,补充粪肠球菌 B-8可能会使鱼对病毒产生较强的抵抗力。
本试验结果显示,4个免疫指标的快速激活揭示宿主细胞免疫系统的激活,在可调范围下处于持续激活状态,能有效抵抗外源病原的入侵。
攻毒保护率试验结果表明：饲喂乳酸菌组的鲫鱼与对照组相比,均可以提高对嗜水气单胞菌的抗病力，具有一定的保护性。
Son 等研究表明：在鱼粮中添加 10的6次方CFU/g乳酸乳球菌饲喂石斑鱼2周后,对杀鲑气单胞菌的存活率在32.2%~34.2%。
结果与本试验相似,说明乳酸菌可以在一定程度上提升机体抗病力,以减少抗生素的使用。
综上,在鱼粮中添加浓度为 1.0x10的8次方 CFU/g的粪肠球菌 B-8 和棒状乳杆菌 W-17 可以提高鲫鱼各脏器中非特异性免疫基因的表达量。
在一些指标上粪肠球菌B-8 的调节能力高于棒状乳杆菌W-17。
究其原因可能是两种乳酸菌的代谢产物有所差异,这说明给鲫鱼饲喂添加粪肠球菌 B-8 的鱼粮可以更好地增强鲫鱼的非特异性免疫,对嗜水气单胞菌具有较好的抗病性。
本试验为粪肠球菌 B-8 在水产养殖中的实际应用提供了理论基础。
