摘要 对虾急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是由致 AHPND 副溶血弧菌(AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus, VpAHPND)携带的 pVA1-like 质粒所表达的 PirAVp和 PirBVp毒力蛋白对对虾肝胰腺的急性毒性所致。
本研究用 2.19×10的5次方 CFU/ml VpAHPND分离株 20130629002S01 对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)进行浸泡感染，于感染后 2~9 d 采集对虾的肝胰腺、鳃、肠道、肌肉组织，采用实时荧光定量 PCR 方法，检测各组织中的 pirAVp 拷贝数。
结果显示，感染后凡纳滨对虾各组织均能检测到 pirAVp，其中，肝胰腺在感染后第 4 天达到峰值, 为 8.71×10的四次方 copies/mg，而鳃、肌肉、肠道分别在第 3、4、5 天达到峰值，分别为 9.08×10的3次方、2.59×10的4次方、5.76×10的4次方 copies/mg。
早期感染鳃组织中先出现 VpAHPND的富集，在高死亡发生期，VpAHPND数量在肝胰腺和肠道出现高峰，在死亡数量逐渐下降的后期，各组织的 VpAHPND 均快速下降，肠道、肝胰腺和肌肉中的 VpAHPND 水平趋于接近。
对虾肝胰腺组织病理切片显示，同一时间有临床症状的病虾和濒死对虾相比，濒死对虾表现出更严重的 AHPND 病理特征，且二者的组织病理特征均随着感染时间的延长变得更为严重，但检测到的 VpAHPND数量呈下降趋势。
研究表明，在 VpAHPND感染过程中，组织中的 pirAVp基因数量不能代表对虾的发病程度，发病程度及组织病理严重的 AHPND 样品中 VpAHPND的数量不一定处于高水平状态。
2010 年 6 月我国南方突发凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)大量死亡的情况，在放苗后 7~31 d 出现肝胰腺萎缩、发黄，死亡率达 90% (张宝存等, 2012)，同时，越南也出现了类似病害(Tran et al, 2013)，在 2010~2014 年期间，该病扩散到了东南亚的马来西亚、泰国以及美洲的墨西哥(Nunan et al, 2014; Sotorodriguezet al, 2014; Joshi et al, 2014)。
该疫病早先被称为早期死亡综合征(Early mortality syndrome, EMS)，对虾发病后的典型症状主要包括肝胰腺颜色变浅、萎缩、空肠空胃、甲壳变软、失去活力等(FAO, 2013; Han et al,2015a; la Peña et al, 2015)，对感染地区的对虾养殖业造成了严重的经济损失(Flegel et al, 2012; Lightner et al,2012)。
张宝存等(2012)最早报道从发病对虾中分离到1 株高毒力及耐药的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，Tran 等(2013)研究表明，导致该病的病原是副溶血弧菌，因病原和病理的明确，该病被重新命名为急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND) (FAO, 2013)，导致 AHPND 的副溶血弧菌（AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus, VpAHPND）携带含毒力基因 pirAVp 和 pirBVp 的 pVA1-like 质粒(Han et al, 2015b; Lee et al, 2015; Yang et al, 2013)，该质粒大小为 70 kbp，可表达毒力蛋白 PirABVp (PirAVp和 PirBVp)，该蛋白是 AHPND 的致病因子(Lee et al,2015)。
目前，多数国内外研究者普遍采用 Tran 等(2013)建立的人工感染方法，使用高浓度（10的8次方 CFU/ml）的VpAHPND 浸泡幼虾 15 min，然后持续在含低浓度（10的6次方CFU/ml）的 VpAHPND 水体中养殖和观察，成功感染的对虾可能在 24~72 h 内接近 100%的死亡，并出现典型的 AHPND 症状，包括肝胰腺色浅、空肠空胃等，病理变化主要表现为肝胰腺小管上皮细胞变薄、脱落。
在养殖过程中，水体中的病原达到如此高的浓度实现直接感染比较困难，绝大多数情况为中低浓度的感染，感染过程中，对虾的临床症状逐渐发生变化。
基于这样的研究背景，本研究围绕凡纳滨对虾VpAHPND 病原感染-病理变化-临床表征的相关性这一关键科学问题，通过对健康凡纳滨对虾进行低浓度的浸泡感染实验，采取组织病理学和荧光定量 PCR 等技术手段确定被感染凡纳滨对虾临床表征、病理变化与 VpAHPND 在体内的组织分布与载量的相关性，为AHPND 的诊断、防控和生物安保体系提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 菌种
副溶血弧菌菌株 20130629002S01 为中国水产科学研究院黄海水产研究所养殖生物疾病控制与分子病理学研究室保存菌株，于 2013 年 6 月分离自广西北海发病凡纳滨对虾幼虾，经鉴定带有毒力基因pirAVp 和 pirBVp，确定为致 AHPND 副溶血弧菌(VpAHPND)，且完成了全基因组序列测定。
1.2 对虾
体重为 1 g 左右的健康凡纳滨对虾购自山东东营对虾工厂化养殖场，将对虾分装到 50 L 水族箱中，保持水温恒定为(27±2)℃，每天投喂饲料 1 次，换水1 次，每次换水量约为 20%，在进行感染实验前于本实验室暂养约 7 d。
1.3 病原检测
随机采集 128 尾对虾，参照 OIE (2017)水生动物疾病诊断手册及已发表文献中的 PCR 方法进行病原检测，包括白斑综合征病毒 (WSSV)、黄头病毒(YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、传染性肌坏死病毒(IMNV)、桃拉综合征病毒(TSV)、偷死病野田村病毒(CMNV) (Zhang et al, 2014)、虾肝肠胞虫(EHP) (Tang et al, 2015)和致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND) (Sirikharin et al, 2014)。
1.4 qPCR 质粒构建及标准曲线制作
用引物扩增长度为135 bp的pirAVp基因片段（表1），连接到 pGEM-T 载体上构建重组质粒 pVpPirA-1(Han et al, 2015b)，转入大肠杆菌(Escherichia coli)后扩大培养提取质粒，Nanodrop 2000 准确测定浓度，然后进行 10 倍梯度稀释，进行荧光定量 PCR，制作标准曲线。
1.5 菌株 20130629002S01 对凡纳滨对虾的毒力检测
取 150 尾凡纳滨对虾，随机分成 5 组，1~4 组为实验组，5 组为对照组，每组设 3 个重复，每个重复20 尾，早晚各投喂 1 次，每天换水 1 次。
将菌株20130629002S01 接种于含 2% NaCl 的 TSB（TSB+）液体培养基中，摇床 155 r/min、28℃培养 12 h，8000 r/min 离心 5 min，收集沉淀，用灭菌海水重悬，测定浓度为 10的9次方 CFU/ml。
将细菌悬液加到水体中，使其浓度依次为 10的8次方、10的7次方、10的6次方和 10的5次方CFU/ml，每天换水后补加菌液，整个感染实验中维持水体中菌的浓度不变；对照组添加等量海水。
实验观察 6 d，每日定时投喂并换水，记录死亡对虾尾数，计算 20130629002S01对凡纳滨对虾的半致死量(LD50)，用无菌牙签沾取肝胰腺部位接种到灭菌 2216E 培养基中，进行 VpAHPND菌株 20130629002S01 重新分离鉴定。
1.6 人工感染实验
设置实验组和对照组，每个组设 3 个平行，每个平行 20 尾凡纳滨对虾，置于 50 L 水族箱中，保持水温恒定为(27±2)℃，早晚各投喂 1 次。
实验组采用菌液浸泡感染，根据 VpAHPND 菌株 20130629002S01 对凡纳滨对虾的毒力检测结果，水体中加入的菌液浓度约为 2.19×10的5次方 CFU/ml，每天换水后补加菌液，整个感染实验中维持水体中菌的浓度不变；对照组添加等量海水。
1.7 组织病理学观察
人工感染后，对照组随机选取凡纳滨对虾实验组分别于 24、48、72 h 选取出现肝胰腺发白、萎缩，疑似感染 VpAHPND 对虾和已失去活力的濒死对虾，将对虾肝胰腺从头胸甲中线切开，一半采用 Davidson’sAFA 固定液固定(Bell et al, 1988)，另一半肝胰腺提取DNA 用于 qPCR 检测；
Davidson’s AFA 固定液固定的头胸甲组织，经过梯度脱水、透蜡、切片后进行 HE染色，中性树脂封片后进行组织病理学观察。
1.8 样本采集和 qPCR 检测
浸泡感染 2~9 d，对照组每天随机选取对虾、实验组每天对濒死凡纳滨对虾肝胰腺、鳃、中后肠道、尾节肌肉进行取样，每个组分别采 3 尾，每个平行 1 尾，将组织样品装入 1.5 ml 空无菌离心管并称重。
依据海洋动物组织基因组 DNA 提取试剂盒(天根生化科技公司, 北京)说明书进行对虾样品 DNA 的提取，加入50 μl 无 RNase 水溶解，并用核酸蛋白测定仪测定其准确浓度和纯度，实时荧光定量 PCR 方法检测各组织中 VpAHPND 数量。
2 结果
2.1 实验虾的检测
对随机取样的 128 尾实验用虾，采用 OIE(2017)标准和文献报道的方法对其进行病原检测，检测结果表明，WSSV、YHV、IHHNV、IMNV、TSV、CMNV、EHP 和 VpAHPND 均为阴性。
2.2 qPCR 标准曲线
提取重组质粒 pVpPirA-1，调整其浓度为 1.0×10的9次方 copies/µl DNA，对已知浓度的 pVpPirA-1 进行梯度稀释，以稀释的梯度溶液为模板进行 qPCR 扩增，确定其标准曲线灵敏度为 10 copies/µl DNA，标准曲线的 R2=0.993，回归方程为：
Ct=–3.235Lg(N)+ 37.555
式中，N 为拷贝数，Ct 为循环数。与 Han 等(2015b)的结果一致。
2.3 VpAHPND 菌株 20130629002S01 对凡纳滨对虾的毒力检测
实验组 1~4 组分别用浓度为 10的8次方、10的7次方、10的6次方和10的5次方CFU/ml 的菌株 20130629002S01 对凡纳滨对虾进行浸泡感染，记录实验组 6 d 内对虾死亡情况（表 2），由 Reed-Muench 法（Brown, 1964）计算出20130629002S01 对凡纳滨对虾的 LD50 为 6.52×10的5次方 CFU/ml；
凡纳滨对虾肝胰腺中的细菌通过重新分离、鉴定，确定可分离出带有毒力基因 pirAVp 可致AHPND 的 VpAHPND。
2.4 感染实验中对虾死亡率
用 2.19×10的5次方 CFU/ml (即 0.34 LD50 )的菌株20130629002S01 浸泡感染凡纳滨对虾，整个感染实验为 11 d。
实验期间，对照组虾肝胰腺正常，切面深棕色，腹节肌肉透明，对虾正常摄食，胃肠道充满食物（图 1a 和图 1b）。
实验组凡纳滨对虾在感染第 2 天开始出现虾体颜色变浅、肝胰腺外观颜色变浅甚至发白、萎缩变小；肝胰腺切面色浅，变淡黄色，呈糜烂状；腹节肌肉透明度下降，变得略微浑浊；对虾停止摄食，出现空肠空胃现象（图 1c 和图 1d），有症状个体会逐渐加重，并在随后几天内死亡。
感染第 2天即出现有发病死亡的对虾，随后死亡对虾数量陆续增加，9 d 的累积死亡率为 33%；在感染 9 d 后，几乎所有存活的对虾都出现虾体颜色变浅、肝胰腺色浅或发白，肝胰腺切面色浅，糜烂明显等症状（图 1e 和图 1f）。
感染组 2~9 d，每天早上统计死亡数并采集对虾肝胰腺、鳃、中后肠道、尾节肌肉样品，选取肝胰腺发白、萎缩且活力明显下降的濒死对虾，根据SigmaPlot 12 回归分析，感染所致的 LT50 为(3.55±0.12) d（图 2）；
对照组除在第 3 天和第 4 天分别意外死亡 1 尾外，其余时间未出现死亡。阳性组与阴性组差异显著(P<0.05)。
2.5 组织病理观察
浸浴感染凡纳滨对虾过程中，取样对虾肝胰腺经石蜡切片和 HE 染色制片，进行光镜下病理观察。
结果显示，对照组对虾肝胰腺小管上皮细胞层饱满，可清晰分辨出 B、R、F 等各种功能细胞，R 细胞内脂肪泡丰富，细胞核大小正常，小管间血窦中血细胞数量不多（图 3g）。
实验组对虾感染后 24 h，出现肝胰腺发白、变浅明显症状的对虾肝胰腺脂肪细胞明显减少，肝胰腺小管上皮细胞偶见脱落现象，部分肝胰腺小管上皮层变薄，血窦中血细胞增多(图 3a)；
对同时期的濒死对虾取样的病理切片的肝胰腺则出现更多肝胰腺小管上皮细胞脱落的现象，此时，部分细胞仍然可以看到还有脂肪滴和分泌泡(图 3b)。
感染后 48 h，出现肝胰腺发白、萎缩、空肠空胃明显症状的对虾肝胰腺出现肝胰腺小管上皮细胞脱落以及细胞核肿大现象(图 3c)；
同时期取样的濒死对虾肝胰腺更是出现了大量血细胞浸润的现象，部分小管出现了大量细菌的二次感染(图 3d)。
感染后 72 h，出现虾体发白、肝胰腺发白、萎缩、空肠空胃明显症状的对虾肝胰腺小管功能细胞缺失，部分小管上皮细胞明显脱落(图 3e)；
同时期取样的濒死对虾肝胰腺小管细胞全面坏死，肝胰腺小管间呈现大量血细胞浸润的炎症反应，多数小管内可见严重的二次感染，出现大量的细菌，部分小管结构完全坏死并被血淋巴细胞围绕形成结节(图 3f)。
2.6 感染进程中 VpAHPND 20130629002S01 在凡纳滨对虾不同组织中的分布
实时荧光定量 PCR 检测结果显示，在各取样时间段，实验组凡纳滨对虾各组织均能检测到 pirAVp，对照组未检测出；
各组织中 pirAVp 基因的拷贝数大致分布在 101~105 copies/mg；组织内的菌量随时间大体呈先上升后下降的趋势（图 4）。
在感染后的 2 d 内，各组织中 pirAVp 的拷贝数都处于较低的水平，肝胰腺、鳃、肠道和肌肉分别为 2.67×10的2次方、3.49×10的一次方、2.09×10的1次方 和 5.09×10的1次方 copies/mg；
随后，pirAVp 拷贝数最早的高峰出现在 3 d 的鳃中，达到 9.08× 10的3次方 copies/mg，且高于此时同一尾虾的肝胰腺 14.3 倍、肠道 6.63 倍和肌肉 1.56 倍；
随后到达高峰的是 4 d 的肝胰腺和肌肉，其中，肝胰腺内的 pirAVp拷贝数达到 8.71×104 copies/mg，分别是同一尾虾肌肉的 3.36 倍、肠道的 6.75 倍和鳃的18.7 倍；
最后达到高峰的组织是感染后 5 d 的肠道，为5.76×10的4次方 copies/mg，此时，是同一尾虾的肌肉的 5.79倍，肝胰腺的 6.44 倍，鳃的 16.3 倍。
每毫克组织中pirAVp 拷贝数对数的所有时段平均值由高到低依次是肝胰腺(3.40±0.80)、肠道(3.30±1.07)、肌肉(3.24±0.88)和鳃(2.71±0.94)。
3 讨论
致 AHPND 副溶血弧菌感染凡纳滨对虾、斑节对虾(Penaeus monodon)、中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis) (Han et al, 2015a)等水产动物后，可导致对虾肝胰腺小管细胞脱落，发生急性坏死，短期内即可导致对虾大规模死亡。
AHPND 作为近年来一种危害较大的对虾新发疫病，病原菌的感染机制以及准确的诊断方法受到广泛关注。
AHPND 的常规 PCR 检测方法(Sirikharin et al, 2014; Otta et al, 2014)以及实时荧光 qPCR 方法(Han et al, 2015b)都已经建立。
前者以检测 pirAVp 或 pirBVp 毒力基因来定性检测 VpAHPND；后者通过检测 PirA 毒力基因拷贝数实现对 VpAHPND的定量检测，从而可定量地分析病原菌的侵染途径。
本研究采用实时荧光 qPCR 方法，灵敏度可以达到10 copies/mg 组织(Han et al, 2015b)，且具有很强的特异性，在探讨 VpAHPND 对凡纳滨对虾的感染途径上是行之有效的方法。
在水环境中，鳃和消化道是对虾与外界接触的重要器官，病原菌可以通过鳃或消化道进入对虾体内，增加了对虾组织受病原菌感染的可能性。
Tran 等(2013)采用非创伤的感染方法，是将 10的8次方 CFU/ml 的高浓度菌液浸浴对虾 15 min，然后再维持 10的6次方CFU/ml 的菌量持续浸浴，这种感染方式除非对虾摄食病虾或高浓度病原菌污染的饲料，否则养殖水体中很难达到这么高的菌浓度。
在本研究测试浸浴条件下 VpAHPND 20130629002S01的LD50，表明该菌株在2.58×10的5次方 CFU/ml持续浸浴就能导致半数死亡，该浓度是普通养殖条件下很容易达到的浓度，说明 VpAHPND 20130629002S01菌株能在普通养殖条件下经水体导致对虾感染，这是养殖条件下 VpAHPND 经水体感染的直接证明。
由于对虾的鳃比表面积大，且与外界水体直接接触，因此，在浸浴感染中，与肝胰腺、中肠和尾节肌肉相比，鳃组织中 VpAHPND 的量最先达到较小的峰值，但这种峰值可能是因为鳃外部富集的病原菌所致，而且，其峰值并没有维持下去，随后肝胰腺及中肠的VpAHPND 量迅速并远远地超过了鳃的水平，因此，鳃的小高峰尚不能表明，鳃是病原菌侵入的通道，对虾的口器与鳃部靠近，并直通虾胃及肝胰腺，更可能成为病原菌直接入侵的通道。
对虾肝胰腺小管上皮细胞脱落是 AHPND的典型症状(Tran et al, 2013)，肝胰腺是 VpAHPND主要靶器官。
本研究实验组肝胰腺中 pirAVp 所代表的 VpAHPND 量在感染后的第 3 天后迅速上升，在第 4 天时达到高峰，且高于所有其他组织出现的最大值，这时正是半数死亡时间，即死亡发生最多的时候，表明对虾的死亡的确是由 VpAHPND 对肝胰腺的侵染造成的。
值得注意的是，病理切片显示，感染时间越长的濒死个体，组织病理切片中见到肝胰腺中的细菌越多，但超过死亡高峰后，肝胰腺 VpAHPND 的量却大大下降，说明此时主要由细菌二次感染所致。
随着感染持续，VpAHPND 从肝胰腺小管中进入肠道，第 5 天时，VpAHPND 的量在中肠中出现峰值。
由于组织病理分析或分子检测都是需要将患病虾致死进行取样，所以，不同时间点的样品来源不可能是同一尾虾。
本研究采用不同时间点每个实验组各取 3 尾的方式进行分析，结果表明，感染后的组织中pirAVp 拷贝数相同时，濒死对虾比呈现 AHPND 典型症状的对虾肝胰腺组织病理变化更重，而感染第 4 天后，濒死对虾即使肝胰腺病变更重，pirAVp 的拷贝数却不升反降，这为采样和检测以及对定性或定量的分子检测的解释提供了参考。
养殖场采样时，不可能知道每一尾对虾确切的感染时间，有时对虾濒死状态的症状典型，但 pirAVp 的分子检测结果阳性强度不高或者定量值很低，并不能以此为依据判断对虾的致病不是 AHPND 所致。
最新发布的 OIE(2017)水生动物手册的 AHPND 诊断章节指出，最好的采样部位是肠道关联的器官，包括肝胰腺、胃、中肠、后肠和粪便。
本研究表明，在经水传播 AHPND 的过程中，发病之前，鳃可能有更灵敏的病原菌检出，而发病高死亡率期间，肝胰腺是最灵敏的可检测组织，而在发病后期，除了肝胰腺和肠道以外，也可选择肌肉。
