摘 要：
为研究饲料中添加丁酸梭菌对草鱼生长性能及血清酶活、免疫功能和抗病能力的影响，选用初始体质量为（23. 78±0. 68） g的健康草鱼 600尾，随机分为 4组，每组 3个重复，每个重复50尾。
对照组（T0组）只投喂基础饲料，实验组（T1、T2、T3组）分别投喂添加1×10的7次方、1×10的8次方、1×10的9次方 cfu/g丁酸梭菌的饲料，实验周期为56 d。
结果表明：与 T0组相比，T1、T2和 T3 组草鱼的增重率（WGR）和特定生长率（SGR）显著增加，存活率（SR）无显著差异。
与 T0组相比，T1、T2和 T3组草鱼的血清超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、溶菌酶（LZM）活性显著增高，补体C3含量显著增高，但谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性显著降低。
与 T0 组相比，T1、T2 和 T3 组草鱼的免疫相关基因白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-1β（IL-1β）、免疫球蛋白M（IgM）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA相对表达量显著上调。
投喂益生菌56 d后，用嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）对草鱼进行攻毒实验，与T0组相比，T1、T2和T3组草鱼的累积死亡率显著降低。
综上所述，饲料中添加丁酸梭菌可以提高草鱼的生长性能、血清抗氧化能力、机体免疫力以及抗病能力。
关键词：丁酸梭菌；草鱼；生长性能；血清抗氧化能力；免疫功能；嗜水气单胞菌
水产养殖是世界上增长最快的食品生产工业之一，水产品是人类消费的主要蛋白质来源，鱼类作为人类食物来源的重要性日益增加。
草鱼肉质鲜美、生长迅速、产量高、价格低，已被引种到 100 多个国家，作为最重要的淡水养殖品种之一，在我国水产养殖业中占有举足轻重的地位，约占我国淡水鱼总产量的20%。
然而，随着养殖规模日益集约化，草鱼的养殖生产近年来受到病毒、细菌等流行病的影响，造成严重的经济损失，例如草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）、嗜 水 气 单 胞 菌（Aeromonas hydrophila）、维氏气单胞菌（A.veronii）等是目前草鱼养殖的主要病害。
嗜水气单胞菌是一种常见的鱼类病原体，可引起草鱼出血性败血症，从而影响其生长，导致养殖草鱼的高死亡率。
抗菌药物、杀虫剂、消毒剂和化学药品在防病促长方面的过度和不当使用，导致草鱼产生耐药性。
为了解决这些问题，已经开发了许多对环境友好的细菌性疾病的生物控制方法，其中使用益生菌在水产养殖中取代抗生素方面的研究受到了广泛地关注。
作为抗生素的替代品，益生菌、益生元和药用植物是控制或治疗水产动物不同疾病最有前景的饲料补充剂。
益生菌作为活的微生物制剂，可以通过维持肠道菌群平衡、稳定肠黏膜屏障功能、增强免疫反应、改善水产养殖的水质、防止水生动物病原微生物的传染性继承来改善宿主健康。
丁酸梭菌（Clostridium butyricum）是研究最多的产丁酸菌之一，是一种厌氧的革兰氏阳性杆菌，具有产生氨基酸、维生素、短链脂肪酸、调节机体免疫力、维持健康等功能。
它已被广泛用作水产动物和牲畜的饲料添加剂，用于治疗肠道炎症，可提高肠道消化酶活性和抗应激能力，并调节肠道微生物群的组成。
此外，丁酸梭菌还可以产生多种酶和营养物质，又可以抑制有害菌、增殖有益菌。
研究表明，在饲料中添加丁酸梭菌后，鮸鱼（Miichthys miiuy）和南美白对虾（Litopenaeus vannamai）受到病原菌感染后存活率显著性提高。短期补充丁酸梭菌也提高了异育银鲫的抗病性。
丁酸梭菌作为新型的饲料添加剂具有非常广阔的前景。
因此，本实验通过在饲料中分别添加1×10的7次方、1×10的8次方、1×10的9次方 cfu/g丁酸梭菌，研究其对草鱼生长性能、免疫功能及抗病性的影响，评估丁酸梭菌在食用饲料中的适宜添加水平，旨在为丁酸梭菌在草鱼的配合饲料中应用提供相关的理论依据。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
试验用丁酸梭菌菌数量 5.0×10的9次方 cfu/g。嗜水气单胞菌为本实验室保藏菌株。实验草鱼来自遵义金鼎镇合江源养殖场。
1. 2 实验饲料
基础饲料组成及营养水平见表 1，本实验采用含丁酸梭菌饲料投喂草鱼。对照组 T0 投喂基础饲料，实验组T1、T2和T3分别投喂添加1×10的7次方、1×10的8次方、1×10的9次方 cfu/g的丁酸梭菌的饲料。
添加方法为将基础饲料原料经过粉碎机粉碎后过 60 目筛，根据添加量为 1×10的7次方、1×10的8次方、1×10的9次方 cfu/g的丁酸梭菌原料按照由少到多的比例分步用混合机充分混合均匀后，然后添加蒸馏水200 g/kg，混合均匀后加工成直径2.0 mm 左右的颗粒饲料烘干，-20 ℃保存备用。
草鱼在实验条件下驯养 2 周并投喂基础饲料。在适应养殖系统后，将600尾初始平均体质量为（23.78±0.68） g的健康草鱼随机分成4组，每组3个重复，每个重复 50 尾，进行养殖。
每天 7：00、19：00投喂饲料达到明显饱腹感为止，投喂 56 d。
实验过程中，水温和 pH 保持在（25±2） ℃和 7.0～7.5，溶解氧含量保持在7 mg/L以上，氨氮<0.2 mg/L，亚硝酸盐<0.005 mg/L，每天换三分之一经过曝气的自来水。
1. 3 样品采集
投喂实验结束时，所有鱼禁食 24 h，然后在解剖前用MS-222溶液麻醉。在饲养14、28、42和56 d时，从每个重复中随机捞取3尾鱼，用无菌注射器尾静脉采血，随后放入4 ℃冰箱，静置 12 h，4 ℃条件下3 500 r/min离心10min，取上层血清分装，置于-80 ℃超低温冰箱保存用于测酶活，鱼皮用 70% 乙醇清洗，立即用无菌剪刀打开腹部，收集脾脏样品在液氮中冷冻，然后快速转移到-80℃冰箱中保存，以便进行后续RNA提取。
1.4 指标测定
1. 4. 1生长性能
在养殖实验结束后测定实验鱼体质量（Bodymass，BM），并对各组鱼进行计数，计算存活率（Survival rate，SR）、增 重 率（Weight gain rate，WGR）和特定生长率（Specific growth rate，SGR），
计算公式：
RWG=（mt－m0）/m0×100%（1）
RSG=（lnmt－lnm0）/d×100%（2）
RS=nt/n0×100%（3）
式中：RWG为增重率，%；
mt为终末体质量，g；m0为初始体质量，g；RSG为特定生长率，%；d为养殖天数，d；RS为存活率，%；nt为终末尾数，尾；n0为初始尾数，尾。
1. 4. 2 酶活性测定
超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、溶菌酶（LZM）、补体C3活性均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。
1. 5 免疫相关基因表达水平的测定
用 Trizol 试剂（Invitrogen）提取总 RNA，根据Promega M-MLV RT说明书逆转录成cDNA，用于实时荧光定量PCR分析。
qPCR的引物序列运用PrimerPremier 5.0软件设计（表2）。根据制造商的说明，利用SYBR Green（TOYOBO）进行qPCR反应，扩增程序：
95 ℃预变性4 min，然后变性95 ℃ 10 s，退火56 ℃20 s，延伸72 ℃ 30s，共40个循环。
实验采用β-actin作为内参基因，2-∆∆Ct方法计算相对表达量。
1. 6 感染实验
饲养实验结束后，进行为期 14 d的嗜水气单胞菌感染实验。每个组留30尾草鱼，每组 3个平行，所有组鱼均腹腔注射0.2 mL浓度为1×10的7次方 cfu/mL 嗜水气单胞菌悬浮液。
每天投喂以及充气换水，攻毒后每日观察实验鱼的发病死亡情况。
1. 7 数据处理与分析
实验结果以平均值±标准差（Mean±SD）表示，采用SPSS 22.0统计软件对所有数据进行单因素方差分析（One-way ANOVE），随后采用Duncan氏进行多重比较，显著性水平定义为P<0.05。
2 结果
2. 1 饲料添加丁酸梭菌对草鱼生长性能的影响
由表3 可知，与 T0 组相比，各实验组的草鱼增重率和特定生长率显著升高（P<0.05），各实验组之间草鱼的增重率和特定生长率无显著差异（P>0.05）。对照组与实验组在存活率上无显著差异（P>0.05）
2. 2 饲料添加丁酸梭菌对草鱼血清酶活指标的影响
由图 1 可知，与对照组 T0 相比，T1、T2 和 T3组草鱼血清中 SOD 的活性显著提高（P<0.05），并随养殖时间延长呈现先增高后降低趋势，在第14天达到峰值（图1a）。
与对照组T0相比，T1、T2和T3 组草鱼血清中 CAT 的活性显著提高（P<0.05）且各实验组的草鱼 CAT 活性随着丁酸梭菌添加量增加而提高，在添加量为 1×10的9次方 cfu/g 时达到最大（图 1b）。
与对照组 T0相比，在第 0天和 14天，T1、T2 和 T3 组草鱼血清 ALT 活性没有显著差异（P>0.05），而在第 28、42、56 天时，所有实验组血清ALT活性显著低于T0组（P<0.05），见图1c。
与对照组 T0相比，在第 0天和 14天，实验组草鱼血清 AST 活性没有显著差异（P>0.05），而在第 28、42和56天时，所有实验组血清AST活性显著低于T0组（P<0.05），见图 1d。
与对照组 T0相比，所有实验组中草鱼血清溶菌酶活性均显著性升高，呈现先增高后降低趋势，在第 28 天达到峰值（图1e）。与对照组 T0相比，第 28、42、56天所有实验组草鱼血清中补体 C3 显著升高（P<0.05），第 14天与对照组无显著性差异（P>0.05），随养殖时间延长补体 C3 也呈现逐渐增高的趋势，在 56 天达到峰值（图1f）。
2. 3 饲料添加丁酸梭菌对草鱼免疫基因的影响
如图 2 所示，Trizol 法提取的草鱼总 RNA 经1.2% 的琼脂糖凝胶电泳检测，图中 3条亮带从上至下依次为 28S、18S、5S，电泳显示 RNA 的完整度较好，可用于下一步实验（图 2a）。
将总 RNA逆转录成 cDNA 后经内参基因 β-actin验证，条带单一逆转录成功，可用于后续 qPCR 实验（图2b）。
在整个实验过程中，与对照组 T0 相比，在T1、T2 和 T3 组中 IL-1β 和 IL-8 表达显著增加（P<0.05），见图 3a 和 3b，随着添加菌量增多 IL-1β 和IL-8 出现增加趋势；
呈现先增高后降低趋势，且都在第 14 天达到峰值，IL-1β 和 IL-8 分别提高到2.3 倍和 2.8 倍（P<0.05）。
同样，在第 14、28、42和 56 天，与对照组 T0 相比，在所有实验组中TNF-α 表显著上调，呈现先增高后降低趋势，在第 28 天 出 现 峰 值 ，TNF- α 提 高 到 2.7 倍（P<0.05），见图 3c。
同样，IgM 也有类似的趋势，都是先升高后降低，与对照组 T0相比，所有实验组均显著升高，在第 28 天出现峰值，提高到 2.6 倍（P<0.05）（图 3d）。
2. 4 饲料中添加丁酸梭菌对草鱼抗病力的影响
嗜水气单胞菌感染草鱼 14 d后，实验组的累计 死 亡 率 显 著 低 于（分 别 为 56.7%、46.7% 和36.7%）对照组（73.3%，P<0.05）。
而且，各实验组T1、T2 和 T3 组之间也差异显著（P<0.05），T3 组草鱼累计死亡率最低。见图4。
3 讨论
3. 1 饲料添加丁酸梭菌对草鱼生长性能的影响
丁酸梭菌作为一种益生菌已广泛应用于水产养殖业中。在之前的研究中，已经报道了许多关于丁酸梭菌在水生动物上应用的研究。
如在黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）的研究中，饲料中添加4.8×10的6次方 CFU/kg的丁酸梭菌可显著提高其生长性能和饲料利用率；同样，在卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）的饲料中添加 2×10的7次方 CFU/g的丁酸梭菌提高了卵形鲳鲹的生长性能和饲料利用率；
在饲料中添加1.7×10的8次方~3.1×10的8次方 CFU/kg的丁 酸 梭 菌 可 以 显 著 提 高 罗 非 鱼（Oreochromisnilotica）的生长性能和饲料利用率；
在斑节对虾（Penaeus monodon）中投喂 1×10的9 次方CFU/g 丁酸梭菌也显著提高了其生长性能。
在本研究中，饲料中添加丁酸梭菌也能够显著提高草鱼的增重率和特定生长率，表明丁酸梭菌有助于提高草鱼的生长性能。
丁酸梭菌对生长性能的积极作用可能与肠道中该益生菌代谢产生的短链脂肪酸如乙酸、丙酸和丁酸有关。
短链脂肪酸能为肠道细胞代谢提供能量来源，提高肠道消化酶的活性，从而促进动物对饲料中营养物质的吸收利用而加快其生长。
3. 2 饲料添加丁酸梭菌对草鱼血清酶活性的影响
鱼类的血液指标与机体代谢、健康状况以及疾病关系密切，因此，血清指标通常作为衡量鱼体营养状况、健康状况和对环境适应状况的关键指数。
超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有催化功能的蛋白质，广泛存在各生物体内，可通过移除体内的超氧阴离子自由基，维持生物体中自由基数量的动态平衡，具有保护暴露于氧气中的细胞和防止衰老的作用。
过氧化氢酶（CAT）是催化细胞内过氧化氢分解的一种酶，防止机体过氧化，保护机体免受氧化物的毒害。
本研究中，由图1a所示，随着添加菌量增多SOD和CAT出现增加趋势；
当饲料中添加 1.0×10的9次方 cfu/g丁酸梭菌时，血清 SOD 在第 14 天时达到峰值且提高到 1.5倍，血清 CAT 在第 56 天时达到峰值且提高到 1.4倍。
表明添加益生菌时，可以提高草鱼血清中SOD和CAT的活性，结果与黄颡鱼、银鲳、卵形鲳鲹和斑节对虾的研究结果一致。
另外也有研究报道，在饲料中添加其他益生菌（地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌），草鱼的 SOD 活性也显著增高。
饲料中添加丁酸梭菌能够提高草鱼的抗氧化能力，可能是由于丁酸梭菌能够清除动物体内的活性氧自由基，降低脂质过氧化反应，而且其代谢产物丁酸也有通过增加抗氧化酶活性和减少活性氧产物，进而调节氧化胁迫的功能。
在其他的研究中也有类似的结果，添加了益生菌后CAT活性增强，表明饲料中添加丁酸梭菌可以抑制自由基的形成，降低过氧化的损害。
补体是先天免疫防御中重要的体液功能分子，在被病原体或者抗原抗体复合物等多种物质激活后能诱导炎症反应和抗体的形成、介导病原体的清除。如图 1f所示，第 28、42、56 天各实验组补体C3水平显著高于对照组。这与石斑鱼（Epinephelus drummondhayi）、鲤（Cyprinus carpio）和金头鲷（Sparus aurata）的研究结果相似，益生菌可以增强鱼类的天然补体活性。
丁酸梭菌作为免疫增强剂添加到饲料中，可以增强水生动物的补体活性，提高水生动物的自身免疫力。
溶菌酶是一种蛋白水解酶，存在于鱼类的体表黏液、肠道黏液、血清和巨噬细胞中，它在鱼类体内的主要作用是杀灭病原微生物，是鱼类抵御病原微生物侵染的重要非特异性免疫因子。
在本研究中，所有实验组溶菌酶活性显著提高，T3 组溶菌酶活性最高。在第 14、28、42、56 天各实验组的溶菌酶活性随着饲料添加量的增加而增高，呈现先增高后降低趋势，在第 28 天达到峰值。
在南美白对虾和鲤中观察到了相似的结果，投喂益生菌后分别在喂食 1~4 周和 7~21 d溶菌酶水平显著提高。
在其他研究也有报道，饲料中添加其他益生菌也显著提高 鱼血清溶菌酶活性，且随添加剂量的增加溶菌酶活性也呈升高趋势。
添加丁酸梭菌后草鱼血清溶菌酶活性均显著升高，表明丁酸梭菌能够有效提高草鱼的非特异性免疫反应。
谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）常被用作蛋白质功能代谢和肝脏功能改变的重要指标。
正常情况下，这两种酶主要在鱼类的肝脏中表达，但是，当机体受外界物质入侵或病原胁迫时，肝脏细胞通透性增强，向血液中转移大量的 AST 和 ALT，使血清 AST 和 ALT 活性增加，低活性的 AST 和 ALT 对鱼类的生长有着积极影响。
本研究中，实验组中草鱼的血清 AST活性在第 28、42 和 56 天时显著降低。实验组的草鱼ALT 酶活性在投喂添加丁酸梭菌的饲料第 14 天内没有明显变化（P>0.05），而在第 28、42、56 天时 ，所 有 实 验 组 血 清 AST 活 性 低 于 T0 组（P<0.05）。
在其他的研究中也有类似的结果，添加了益生菌后AST的活性降低。推测饲料添加丁酸梭菌有助于保护草鱼肝脏功能和促进生长。
3. 3 饲料添加丁酸梭菌对草鱼免疫基因的影响
众所周知，细胞因子 IL-1β 在鱼类和哺乳动物的免疫反应中发挥着重要作用［33］。
它作为响应组织损伤和病原体入侵的重要介质，可以通过诱导其他能够触发巨噬细胞、淋巴细胞和 NK 细胞的细胞因子的释放或通过激活淋巴细胞来刺激免疫反应。
在本研究中，实验组的 IL-1β 表达显著高于对照组。类似地，在 LIU 等的研究中，用添加短乳杆菌和嗜酸乳杆菌的饲料投喂杂交罗非鱼幼鱼 10 d，IL-1β 基因表达显著上调。
在另一个研究中，饲料中添加黄杆菌会使鲤 IL-1β 的表达也显著增加。白细胞介素８是一种中性粒细胞趋化因子，可以特异性趋化中性粒细胞进入到机体中的炎症部位，促使中性粒细胞脱颗粒，并产生超氧阴离子，同时引起呼吸爆发等，在免疫反应中发挥重要作用。
IL-8是另一种白细胞介素型细胞因子，与对照组相比，在所有实验组均显著上调。
这与另一个研究结果类似，草鱼投喂枯草芽孢杆菌后，IL-8 的表达也上调。
TNF-a是一种多功能的促炎因子，能够参与先天免疫，并引起细胞凋亡，其在调节炎症反应和细胞免疫反应时具有多种功能。
与 IL-1β 类似，TNF-α 基因在炎症事件中也起着至关重要的作用。本研究结果表明，所有实验组TNF-α基因表达在投喂 14 d 后显著高于对照组。
在幼鱼杂交罗 非 鱼 、草 鱼 和 罗 氏 沼 虾（Macrobrachiumrosenbergii）中投喂益生菌也观察到了类似的结果。
上述研究表明饲料中添加丁酸梭菌可以增强机体免疫因子调节免疫反应。众所周知，免疫球蛋白可以保护动物和人类免受各种疾病的侵害，鱼类血清Ig水平提供了有关体液免疫状态的关键信息。
Ig在预防细菌、寄生虫和病毒感染以及从疾病中恢复方面都很重要。
IgM 是主要的免疫球蛋白，也是迄今为止循环系统中体积最大的抗体。先前已在各种鱼类中报道了在投喂益生菌后刺激了免疫球蛋白水平。
在本研究中，喂食14 d后，投喂益生菌饲料的鱼血清IgM表达显著高于对照组，这与之前的研究一致。
上述结果表明饲料中添加适量的丁酸梭菌可提高草鱼的免疫力，有助于提高其抗病力。
3. 4 饲料添加丁酸梭菌对草鱼抗病性的影响
所有添加益生菌组草鱼用嗜水气单胞菌进行 14 d感染后，草鱼的累计死亡率与对照组相比显著降低，T3组的草鱼累计死亡率最低。
丁酸梭菌保护草鱼免受嗜水气单胞菌侵害的原因可能是其改善了宿主先天免疫应答或提升了免疫相关基因表达量。
在虎龙斑饲料中添加丁酸梭菌可以降低哈维氏弧菌攻毒后的累积死亡率。
在虎龙斑饲料中添加芽孢杆菌和光合细菌也能提高哈维氏弧菌攻毒之后鱼的成活率。
在饲料中添加芽孢杆菌也能够显著提高罗非鱼、虹鳟鱼和虾的抗病力。这些结果表明饲料中添加丁酸梭菌可降低草鱼的累计死亡率，增强其抗病能力。
饲料中添加丁酸梭菌可以显著增加草鱼的WGR 和 SGR，提高血清 SOD 和 LZM 的活性以及C3 含量，降低 AST 的活性，显著增加了免疫相关基因IL-8、IL-1β、IgM和TNF-α的表达，显著增加了抗病性。
综上所述，饲料中添加丁酸梭菌可以显著促进草鱼的生长，增强机体免疫力，提高机体抗氧化能力和抗病能力。
