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纳米酶是一种具有类酶催化特性的纳米材料，与天然酶相比，具有成本低、稳定性强和易于大量生产等优点。通过合理的设计，纳米酶被赋予了多种催化及环境响应功能，从而广泛扩展了其应用领域。糖尿病慢性伤口是当前面临的一项重大医疗挑战，具有愈合延迟、发病率高、致残率高、死亡率高以及医疗成本高昂的特点，迫切需要新的策略来杀菌并促进糖尿病创面愈合。利用纳米酶催化产生活性氧自由基（ROS）来根除细菌，是一种极具吸引力的方法。湖北大学化学化工学院电化学与电分析课题组文为教授，熊华玉副教授等联合健康科学与工程学院梁继超副教授在纳米酶抗菌及促进糖尿病创面愈合研究方向取得了进展，相关研究成果发表在Biomacromolecules(DOI:10.1021/acs.biomac.4c00261)上。
金属-共价有机框架（MCOFs）是通过在COFs骨架中加入金属原子而得到的，也称为金属化COFs。研究发现，具有潜在配位位点的COFs可以作为超分子配体和载体，结合和稳定金属离子或含金属的纳米颗粒。通过在有机结构单元生长过程中引入金属离子制备的MCOFs，不仅继承了传统COFs的多孔性、结构可设计性、稳定性和结晶度高等优点，还具备优良的纳米酶催化活性，在生物医学领域具有广泛的应用前景。
卟啉光敏剂5,10,15,20-四（4-氨基苯基）卟啉（TAPP）是一种结构对称的光敏剂，带有游离氨基，它可作为构建具有光疗功能COF的单体。在这项研究中，作者采用了自组装策略，在室温下加入三氟甲基磺酸铁（II）（Fe(OTf)2），3,3’-联吡啶-6,6’-二甲醛（BPA）与TAPP，由于Fe-N配位及酰胺缩合反应，合成了由Fe-亚氨基吡啶分子连接的高结晶Fe-COF。通过静电吸附引入透明质酸（HA），构建了多功能HA-Fe-CO纳米平台，并将其用于高效消除细菌，促进糖尿病伤口愈合的研究（图1）。
图1. HA-Fe-COF的合成过程及促糖尿病伤口愈合机制图
作者首先用电镜、能谱、光谱等多种测试方法对合成的Fe-COF及HA-Fe-COF进行了表征，证明了高结晶MCOF及多功能HA-Fe-COF的成功合成，如图2所示。
图2. Fe-COF和HA-Fe-COF的表征
接着，作者探究了Fe-COF和HA-Fe-COF的类过氧化物酶（POD）酶活性，并证实了反应过程中·OH的生成，通过动力学分析计算米氏常数和最大反应速度来评价Fe-COF的催化效率，并构建了Fe-COF和Fe3O4（111）两种纳米酶模型，对FeN2位点的H2O2还原进行了密度泛函理论（DFT）计算，阐明了Fe-COF的POD催化机理，如图3所示。
图3. Fe-COF和HA-Fe-COF的酶活性及催化机制探究
随后，作者评估了HA-Fe-COF在808 nm（1.2 W cm-2）激光照射下的光热效应，光热稳定性能，并计算了HA-Fe-COF的光热转换效率（η）为29.18％。此外，作者还测量了HA-Fe-COF在660nm光照射下产生单线态氧（1O2）的性能，对Fe-COF的光学性质如带隙、荧光寿命等进行了研究，测量并计算了材料的HOMO及LUMO能级，深入探讨了HA-Fe-COF生成1O2的机制（图4）。
图4. HA-Fe-COF光热及光动力性能及机制研究
基于上述特性，作者选择金黄色葡萄球菌作为体外抗菌研究的代表细菌，采用平板涂布实验，SEM，细菌细胞膜通透性实验，RT-qPCR，生物膜结晶紫染色及3D-CLSM等测试方法评估了HA-Fe-COF的抗菌活性及其抗菌机制（图5）。
图5. 体外抗菌实验研究
在进行动物实验之前，作者通过MTT测定和溶血实验评估了HA-Fe-COF的生物相容性（图6）。随后探究了HA-Fe-COF对HUVECs增殖和迁移的影响，表明HA-Fe-COF中的透明质酸可能作为一种信号分子，促进各种生物功能，如细胞附着、增殖和迁移等。
图6. HA-Fe-COF生物相容性
基于HA-Fe-COF在体外抗菌的良好效果，作者通过感染金黄色葡萄球菌的糖尿病伤口模型评估了HA-Fe-COF的抗菌和促进糖尿病伤口愈合能力，如图7所示。首先建立了链脲佐菌素诱导的I型糖尿病大鼠模型，在糖尿病大鼠背侧皮肤上对称切除10 mm全层切口，并随后在伤口喷涂金黄色葡萄球菌悬液感染伤口，建立糖尿病慢性伤口模型，大鼠背部均观察到伤口感染。与对照组相比，不管是单模式治疗组还是协同治疗组，伤口感染有明显的缓解，协同治疗组的伤口愈合最快，在第15天几乎完全愈合。在第7天取伤口皮肤，通过H&E染色和Masson染色观察不同处理创面的组织学变化。协同治疗组伤口表现出明显的再上皮化，毛囊和皮脂腺增多，表皮和真皮层相对完整，胶原排列有序且致密，炎症细胞几乎消失，表明协同抗菌组愈合效果最好。
图7. 体内抗菌研究
随后免疫组织化学染色CD31和VEGF研究伤口新生血管的形成（图8）。与空白对照组相比，HA-Fe-COF治疗组CD31和VEGF的表达增加，微血管密度明显增加，证明HA-Fe-COF促进微血管生成，而微血管生成进一步缓解局部缺氧。同时，免疫组织化学染色Ki67显示，HA-Fe-COF处理后，Ki67蛋白水平显著升高，表明HA-Fe-COF同时也可以促进细胞的增殖，加速伤口愈合。
图8. 大鼠创面组织免疫组化结果及统计
为了确保HA-Fe-COF在潜在临床应用中的安全性，作者在第15天取出血液和主要器官（肝、脾、肾、心、肺），通过血液生化检查和器官组织切片病理分析对HA-Fe-COF进行了体内生物安全性评估。与对照组相比，治疗组的总蛋白（TP）、血清肌酐（CREA）、血清尿素（UREA）、天冬氨酸转氨酶（AST）、磷酸酶（ALP）、尿素氨（UA）等指标均在正常范围内（图9）。此外，对大鼠主要器官（肝、脾、肾、心、肺）的组织切片进行病理学分析，与对照组相比，实验组未发现炎症反应和明显的组织病变迹象，表明HA-Fe-COF体内的生物安全性。综上所述，本研究合成的HA-Fe-COF在体内具有良好的生物安全性，可以促进伤口愈合而不产生毒性。
图9. 大鼠六项血液生化指标及心、肝、脾、肺、肾组织切片H&E染色
综上所述，在细菌感染的环境中，HAase的过量产生会导致HA降解，进而使释放出Fe-COF释放并催化H2O2生成·OH，用于CDT抗菌和生物膜的清除。此外，卟啉在COF骨架内的结合使Fe-COF具有较高的光热转化率和1O2生成效率，通过PTT和PDT协同治疗增强了抗菌效果。应用于糖尿病大鼠模型后，HA-Fe-COF表现出卓越的伤口愈合能力，且对健康组织和器官的毒性非常小。总之，HA-Fe-COF具有合成简单、光热性能优异、ROS生成能力强、生物安全性好的特点，是一种很有前景的皮肤感染创面协同治疗材料。
该论文共同第一作者为湖北大学化学化工学院硕士生陈奕丹及中科院北化所博士生冯甜甜，共同通讯作者为湖北大学化学化工学院文为教授，熊华玉副教授及湖北大学健康科学与工程学院梁继超副教授。该论文特别感谢中科院北化所的王栋教授在COFs材料的设计、制备与表征方面给与给予的指导。
