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Nanozymes
急性肝衰竭（ALF）是一种以肝细胞坏死和肝功能迅速衰退为特征的临床综合征，这与ALF高死亡率密切相关。随着肝功能衰退进展到终末期，肝移植成为最有效的治疗方法。然而，现有肝移植的供体库仅能满足不到10%的临床需求。因此，大量患者在等待肝移植期间不幸去世。鉴于此，迫切需要开发和优化替代治疗策略，以挽救更多患者。
细胞疗法，特别是使用干细胞的静脉输注疗法，被视为治疗ALF的一种有前途的替代方法。然而，这种方法面临几个挑战：1）肝内植入效率低，大部分干细胞会滞留在肺部或被巨噬细胞和单核细胞清除；2）细胞无法提供必要的肝细胞功能，如解毒、蛋白质合成和代谢等；3）由于ALF高水平活性氧（ROS）和过度炎症的微环境特征，移植后细胞的存活率和功能活性较低。因此，开发新策略以提高治疗性细胞移植的效率、增强细胞的存活率和维持其生物功能，对于提升细胞疗法在ALF治疗中的有效性至关重要。
图1 金簇纳米酶-肝细胞样细胞球微组织片的制备及治疗ALF的示意图。
中山大学附属第三医院陶玉研究员/李明强研究员团队采用3D打印技术构建了含抗氧化纳米酶的肝细胞样细胞（HLCs）微组织片，用于ALF的原位移植治疗（图1）。通过应用肝脏脱细胞外基质（dECM）、凝血酶和纤维蛋白原水凝胶，封装由干细胞分化的HLCs球体（HS@dECM），有效地维持包被细胞的功能。此外，利用3D打印技术制备装载N-乙酰半胱胺酸-金纳米簇（NAC-Au NCs）纳米酶的支架，一方面可以为HLCs球体提供机械支撑，起到保护肝细胞球的功能，另一方面可有效缓解ALF炎症和氧化应激微环境，从而保护受损的肝组织并促进肝脏再生，在ALF小鼠模型中取得了令人满意的治疗效果。相关工作以"3D printing incorporating gold nanozymes with mesenchymal stem cell-derived hepatic spheroids for acute liver failure treatment"题发表在Biomaterials上。
我们首先在碱性条件下使用NAC作为还原剂和封端剂合成了NAC-Au NCs。NAC-Au NCs的直径范围在2.0至3.0 nm之间，表面带有负电荷（-41.89 ± 0.86 mV）。进一步，我们评估了NAC-Au NCs清除ROS的效率。结果显示，随着NAC-Au NCs浓度的增加，对不同ROS的清除效率均有提高。当NAC-Au NCs的浓度达到500 μg/mL时，对H2O2、·O2−和·OH的清除率分别达到63.38%、77.31%和95.84%，表明NAC-Au NCs对多种ROS均具有显著的清除能力（图2）。
图2 NAC-Au NCs表征与类酶活性分析。
鉴于NAC-Au NCs优异的生物相容性和ROS清除能力，我们探究了其清除细胞内ROS的潜力（图3）。作为对照，AML12细胞暴露于500 μM H2O2中其存活率显著下降。应用不同浓度的NAC-Au NCs处理后，显示出增强的细胞活力，其中400 μg/mL处理组的存活率接近100%。此外，我们比较了同一浓度NAC-Au NCs与NAC在细胞保护作用上的差异。发现与NAC组相比，NAC-Au NCs组的细胞活力显著提高。DCFH-DA染色和流式细胞术分析进一步证实了NAC-Au NCs处理后细胞内ROS水平的降低，突显了NAC-Au NCs在ROS清除和细胞保护方面的高效能力。进一步，我们还验证了NAC-Au NCs在脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7细胞中的抗炎特性。NAC-Au NCs处理可显著上调抗炎基因IL-10、ARG1和MRC1，同时下调促炎基因IL-1β、NOS2和TNF-α。
图3 NAC-Au NCs的ROS清除能力和抗炎能力分析。
人脂肪间充质干细胞通过细胞因子诱导分化为HLCs，我们利用PDMS微孔阵列技术制备了HLCs球体（图4）。同时，我们监测了HLC球体中肝细胞特异性基因的表达。与平板培养的HLCs相比，HLCs球体显示出更高的ALB、CYP3A4和CK18基因表达水平。免疫荧光染色结果也显示HLCs球体内肝细胞相关蛋白ALB和HNF4α的表达显著提高。
图4 HLCs球体的表征分析。
为了高效递送HLCs细胞球，我们将其封装在肝脏来源的dECM水凝胶中（图5）。同时，我们向dECM中添加了凝血酶和纤维蛋白原，以增强水凝胶的机械强度并减少胶凝时间，。此外，为了模拟肝脏的肝小叶结构并维持HLCs球体的活力和功能，我们利用3D生物打印技术设计并制造了掺杂NAC-Au NCs的方形网格水凝胶支架。这种支架展示了出色的ROS清除效率，有助于保护HLCs球体（HS/N-Au@composite）。
图5 HS/N-Au@composite的表征。
基于HS/N-Au@composite复合材料的协同ROS清除活性和肝功能支持作用，我们探究了该材料在植入后1天和3天对CCl4和APAP诱导的ALF的治疗潜力（图6）。研究显示，HS/N-Au@composite复合材料具有抗凋亡、促进细胞增殖、抗氧化和抗炎作用，能有效恢复肝功能指标和小鼠体重，并促进肝脏的修复与再生，从而有效治疗ALF。该研究为纳米酶联合细胞治疗肝脏疾病提供了新策略。
图6 HS/N-Au@composite对ALF模型的治疗效果评估。
