大家好，今天给大家分享一篇发表在《Biomaterials》上的文章“Hypoxia-accelerating pyroptosis nanoinducers for promoting image-guided cancer immunotherapy”，吉林大学邴薇教授、南开大学齐迹教授和中国医学科学院和北京协和医学院Wen Li为共同通讯作者。![]()
1．简介
精准的图像引导癌症免疫疗法在彻底改变癌症治疗方面具有巨大潜力。促进可激活成像和可控治疗的策略是人们非常期望开发的，但尚未开发。
在本研究中，作者报道了一种新的细胞焦亡纳米诱导剂，该诱导剂将聚集诱导发光发光体 (AIEgen) 和 DNA 甲基转移酶抑制剂与缺氧响应共价有机框架 (COF) 相结合，用于先进的图像引导癌症免疫治疗。我们首先合成并比较了三种具有不同数量吸电子单元的供体-受体型 AIEgen，发现两种受体的结合产生了最长的响应波长和最有效的光动力疗法 (PDT) 特性，超过了具有一个或三个受体基团的类似物的性能。通过一锅法成功构建了包含 AIEgen 和细胞焦亡药物的基于 COF 的纳米平台。COF 内的能量转移显着猝灭了 AIEgen，其中缺氧引发的 COF 降解使荧光和 PDT 特性都大大增强。此外，光动力过程加剧了缺氧，加速了细胞焦亡药物的释放。纳米剂通过原位可激活的荧光特征能够敏感地描绘肿瘤部位。由于卓越的 ROS 生成能力和缺氧加速药物释放，纳米剂不仅抑制原发性肿瘤生长，而且还通过强大的细胞焦亡介导的免疫反应阻碍了 4T1 肿瘤小鼠的远处肿瘤进展。
【AIEgen 和 DNA 甲基转移酶抑制剂整合到缺氧响应性 COF 中以增强图像引导的细胞焦亡介导的癌症免疫治疗的示意图】
本研究设计并合成了三种具有不同数量 A 基团（即一个、两个和三个 A 基团）的供体-受体 (DA) 型 AIEgen。有趣的是，我们发现加入两个 A 单元可以获得最长的响应波长和最有效的 PDT，超过了具有一个和三个 A 基团的类似物的性能。随后将高性能 AIEgen、DNA 甲基转移酶抑制剂 DAC 和两种单体整合在一起，通过一锅合成法制备出缺氧响应性 COF 平台。该 COF 由含偶氮苯 (azo) 基团的单体构成，可以通过 PET 效应猝灭负载到纳米孔中的 AIEgen 的荧光和 PDT 属性。在缺氧引发偶氮基 COF 降解后，AIEgens 的荧光和 PDT 特性均显著增强，同时 DAC 的控制释放。DAC 可通过上调 gasdermin E (GSDME) 的表达来促进肿瘤细胞焦亡诱导。此外，PDT 介导的 ROS 生成可激活 caspase-3 的表达，随后 caspase-3 裂解 GSDME 以产生 GSDME-N 结构域，导致膜穿孔并执行焦亡。因此，DAC 和基于 AIEgen 的 PDT 的整合可有效增强肿瘤细胞焦亡诱导。AIEgen 诱导的 PDT 将进一步消耗氧气并加剧缺氧，从而加速光疗激活和药物释放过程。将纳米剂静脉注射到荷瘤小鼠体内后，该纳米剂表现出通过原位可激活荧光特征敏感地描绘体内肿瘤部位的能力。同时，强效PDT效应与DNA甲基转移酶抑制剂的协同作用导致肿瘤细胞高效焦亡。纳米药剂不仅抑制了原发性肿瘤的生长，还通过强烈的焦亡促进免疫反应阻止了4T1荷瘤小鼠远处肿瘤的进展。这项研究引入了一种新的策略来实现发光剂的可激活诊疗性能和自加速药物释放，从而推进协同癌症免疫治疗。![]()
图1. AIEgen 和 DNA 甲基转移酶抑制剂整合到缺氧响应性 COF 中以增强图像引导的细胞焦亡介导的癌症免疫治疗的示意图。
【AIE化合物的表征】
T-1TM、T-2TM 和 T-3TM 的化学结构如图2a所示。如图2 c所示，T-1TM、T-2TM 和 T-3TM 在 THF 中的最大吸收/光致发光 (PL) 波长分别为 484/650、499/655 和 470/642 nm。在所有化合物中，T-2TM 显示出最长的波长响应。尽管 T-3TM 的共轭性比 T-2TM 更好，但是分子内 DA 相互作用减弱，因此响应区域表现出减色偏移。在乙腈（良溶剂）和水（坏溶剂）的混合溶剂中进一步研究了不同聚集状态下的 PL 性质。如图2 d 所示，随着乙腈/水混合物中水分数（ f w ）的增加，PL 强度最初呈下降趋势，然后在较高的f w值下增强。如图2e所示，在所有化合物中，T2NPs 表现出最强的 ROS 生成能力。为了阐明这种现象的根本原因，计算了单线态激发态和三线态激发态之间的能隙 (ΔEST ) ，因为它可以为系统间窜越 (ISC) 过程提供参考。T -1TM、T-2TM 和 T-3TM 的ΔEST值分别确定为 0.036 eV、0.004 eV 和 0.031 eV（图 2f）。在 T-2TM 中观察到的显著 ROS 生成可归因于其最小的 ΔE ST ，这表明 ISC 过程是有效的。![]()
图2. AIE化合物的表征。
【纳米制剂的制备和表征】
如图3a所示，首先以F127为表面活性剂，通过纳米沉淀法将T-2TM、DAC、4,4-偶氮二氨基苯（AD）和1,3,5-三甲酰基-2,4,6-三羟基苯（TP ）单体制备成NPs，然后通过基于席夫碱反应的一锅法合成TD@COFs。如图3c所示，透射电子显微镜 (TEM) 和动态光散射 (DLS) 测量表明，TD@COF 呈现出一种球形结构，平均直径约为 120 nm。采用 TEM 和 DLS 研究此过程中 NP 形貌的变化。经 Na 2 S 2 O 4处理后，TD@COFs 的形貌转变为超过 300 nm 的较大聚集体（图 3d），这归因于 TD@COFs 的降解。记录了 TD@COFs 的光物理性质和缺氧引起的变形。有趣的是，与相同浓度的 TD@COFs 相比，在 Na 2 S 2 O 4存在下降解 TD@COFs 时 PL 强度明显增强（图 3e）。光照后，TD@COFs的ROS生成能力在缺氧处理后也有所增强（图3f）。而在常氧和缺氧条件下，TD@nCOFs光诱导的1 O 2生成能力几乎没有变化。通过高效液相色谱（HPLC）监测DAC的按需释放。如图3g所示，Na 2 S 2 O 4浓度升高导致TD@COFs中DAC的释放增加，凸显了TD@COFs在控制细胞焦亡诱导物递送方面的潜力。这些发现表明，该纳米平台不仅能够控制药物释放，而且还能显着激活荧光亮度和PDT功效。![]()
图3. 纳米制剂的制备和表征。
【体外细胞研究】
如图4a和b所示，TD@COFs的红色荧光信号表现出时间依赖性增强，表明细胞内化随时间的增加。据报道，偶氮还原酶在缺氧条件下在癌细胞中过表达，这会破坏TD@COFs的结构并释放T-2TM和DAC。如图4b所示，在缺氧条件下与TD@COFs共孵育的4T1细胞中观察到明显更亮的荧光信号，与常氧条件下相比增加了两倍以上。这种增强可归因于TD@COFs在缺氧环境下的降解，从而放大了荧光强度——这一现象与溶液中的发现一致。在缺氧刺激下（图 4 c-e），游离 DAC 和 TNPs + 光照射组均表现出与常氧状态下观察到的相当的肿瘤杀伤能力。有趣的是，无论有无光照，TD@COFs 都表现出比常氧条件下显著更高的毒性。
如图4f和 g 所示，CLSM 图像显示，在没有光照的情况下孵育各种制剂后，绿色荧光信号消失。相反，'TNPs + L' 和 'TD@COFs + L' 组的 ROS 荧光信号明显增加，证实了它们强大的细胞内 PDT 能力。![]()
图4. 体外细胞研究。
【细胞焦亡诱导和免疫原性增强】
评估了不同治疗后 4T1 肿瘤细胞中乳酸脱氢酶 (LDH) 和三磷酸腺苷 (ATP) 的释放水平。作为细胞焦亡过程中细胞内内容物漏出的关键指标，LDH 释放量在 'TD@COFs + L' 组中最高，分别比 'TNPs + L' 和 'TD@COFs' 组高出约 2.2 倍和 1.6 倍（图 5a）。同样，'TD@COFs + L' 组细胞内 ATP 含量显著下降，表明其 ATP 释放效率在所有治疗组中最高（图 5b）。如图5c所示，在'TD@COFs + L'组中可以观察到明显的细胞焦亡特征，例如细胞肿胀和质膜产生气泡。相反，'TNPs + L'组出现少量细胞焦亡，而'DAC'和'TD@COFs'组出现更多的细胞焦亡，其特征是细胞收缩和产生焦亡小体。这表明单一DAC药物或PDT效应不足以诱导细胞焦亡。此外，研究了在不同时间点用TD@COFs处理的4T1细胞中细胞焦亡的进展。光照后，大多数细胞在9小时后发生细胞焦亡，12小时后细胞倾向于破裂（图5d）。这些结果证实了 DNA 甲基转移酶抑制剂 (DAC) 和 ROS 生成器 (T-2TM) 的协同作用显著引起了强烈的细胞焦亡。还进行了蛋白质印迹法分析 4T1 细胞中细胞焦亡相关蛋白的表达。值得注意的是，在 'TD@COFs + L' 组中观察到裂解的 GSDME-N 表达显著升高，表明成孔活性（图 5e）。与单独的 TD@COFs 相比，'TD@COFs + L' 组中 GSDME-N 含量增加，凸显了基于 AIEgen 的 PDT 在扩增 DAC 诱导的细胞焦亡中的关键作用。图 5f -i中的免疫荧光染色结果显示，在用TD@COFs 加光处理的细胞中，HMGB1 从细胞核明显易位到细胞外，CRT 暴露于细胞膜上。定量分析表明，'TD@COFs + L'组的HMGB1释放和CRT暴露分别是PBS组的8.8倍和7.1倍。用 ELISA 试验进一步分析释放到细胞上清液中的 HMGB1（图 S30）。经 'TD@COFs + L' 处理的 4T1 细胞中 HMGB1 的明显释放与 CLSM 结果一致。细胞焦亡导致的细胞内容物泄漏和促炎细胞因子释放会激活树突状细胞 (DC)。为了说明这一点，从 BALB/c 小鼠的胫骨和股骨中分离出骨髓来源的树突状细胞 (BMDC)。随后，将 4T1 癌细胞接种在 transwell 的上室中并暴露于不同的处理。BMDC 在下部 transwell 隔室中共培养，并通过流式细胞术检查各组 BMDC 的成熟情况。![]()
图5. 细胞焦亡诱导和免疫原性增强。
【体内肿瘤成像及抗肿瘤性能】
如图6a和b所示，在肿瘤部位可以明显看到强劲的NIR荧光信号，在注射后约8小时达到最大值。值得注意的是，即使在给药后48小时，TD@COFs的NIR荧光信号仍然持续存在于肿瘤部位，表明它们具有出色的肿瘤内滞留性和长期肿瘤追踪的潜力。静脉注射后48小时，切除主要器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）和肿瘤进行离体成像。结果显示，明亮的荧光信号集中在肿瘤区域（图6c和d）。肿瘤接种后 7 天，当肿瘤体积达到 ∼100 mm 3时，将小鼠随机分为 6 组（每组 5 只小鼠），并接受不同的治疗：PBS、DAC、TNPs、TNPs + L、TD@COFs 和 TD@COFs + L。在标有“L”的组中，在注射后 8 小时用白光（0.3 W cm- 2）照射肿瘤部位 5 分钟（图 6e）。注射和光照射分别在第 0、3、6 和 9 天重复四次。每隔一天监测肿瘤生长和体重。如图6f和 g 所示，与 PBS 组相比，用 DAC、'TNPs + L' 或 TD@COFs 处理的小鼠表现出中等程度的肿瘤抑制，表明单一 DAC 或 PDT 具有一定的肿瘤杀伤效果。有趣的是， 'TD@COFs + L'组肿瘤体积明显受到抑制。第 15 天，'TD@COFs + L'组平均肿瘤体积（120 mm 3）分别比 PBS 组（1278 mm 3）、DAC 组（649 mm 3）、TNPs 组（541 mm 3）、TNPs + L 组（1142 mm 3）和 TD@COFs 组（387 mm 3）小约 10.6 倍、5.4 倍、4.5 倍、9.5 倍和 3.2 倍。此外，第 14 天收获的分离肿瘤重量证实了'TD@COFs + L'治疗与其他干预措施相比具有更优的抗肿瘤效率（图 6h和图 S34）。这些结果表明，TD@COFs 协同递送和靶向释放 DAC 和 T-2TM 可以显著提高肿瘤抑制效率。值得注意的是，不同治疗方法下小鼠的体重差异可以忽略不计，表明生物相容性优异。通过免疫荧光染色进一步评估肿瘤组织中的 ROS 水平。CLSM 图像显示，'TNPs + L' 和 'TD@COFs + L' 组均产生强烈的 ROS（图 6i和 j），表明 AIEgen 介导的强效 PDT 效应。'TD@COFs + L' 处理的肿瘤组织中较高的荧光信号可归因于缺氧增强的 PDT 特性。![]()
图6. 体内肿瘤成像及抗肿瘤性能。
【激活全身抗肿瘤免疫】
如图7a和b所示，'TD@COFs + L'组成熟树突状细胞（CD80 + CD86 +细胞）的比例明显较高，达到35.6%，与PBS（13.2%）、DAC（16.6%）、TNPs（12%）、TNPs + L（23.7%）和TD@COFs（21.2%）组相比均有显著升高。这一观察证实了协同细胞焦亡效应可以有效增强肿瘤的免疫原性并促进DC成熟。接下来，我们评估了CD8 + T细胞在肿瘤组织中的浸润。作为抗癌免疫反应中的有效效应物，CD8 + T细胞（也称为细胞毒性T淋巴细胞（CTL））在直接识别和消除癌细胞方面起着至关重要的作用[ 72 ]。如图7c和 d所示，'TD@COFs + L' 组肿瘤部位内CD8 + T 细胞比例显著增加，与其他组相比， CD8 + T 细胞向肿瘤的浸润增加了 1.31 至 3.47 倍。此外，我们还检查了调节性 T 细胞（Tregs，CD3 + CD4 + CD25 + Foxp3 +）的肿瘤内水平，因为它们在促进免疫抑制微环境和抑制 CTL 的有效抗肿瘤免疫反应中发挥作用。很明显，'TD@COFs + L' 组中 Tregs 的频率明显低于其他组（图 7e和 f），证实'TD@COFs + L' 可以有效减轻肿瘤相关的免疫抑制以增强抗肿瘤免疫反应。下来，建立双侧肿瘤模型，以检查TD@COFs的免疫增强作用是否会发挥远端效应来抑制未治疗的远处肿瘤的生长。如图7g所示，在第-7天将4T1癌细胞植入雌性BALB/c小鼠的右侧。接种原发肿瘤六天后，将等量的癌细胞植入左侧以模拟远处肿瘤的存在。体内癌症治疗通过在第0天全身给药各种制剂，然后在注射后8小时对原发肿瘤进行局部光照射（0.3 W cm −2，5分钟）。分别在第3、6和9天重复治疗。每两天仔细监测两侧肿瘤的进展以评估治疗效果（图7h和i）。未经光照的TNPs处理组中原发性肿瘤和远处肿瘤的生长模式与PBS组相似。游离DAC处理对原发性肿瘤和远处肿瘤也表现出较弱的抑制作用，这可能归因于其在循环中的半衰期短和肿瘤蓄积性差。。此外，'TD@COFs + L' 组小鼠的生存时间显著延长，5 只荷瘤小鼠中有 4 只存活超过 37 天（图 7 j）。肺转移是乳腺癌患者面临的重大临床挑战，评估肺转移情况是评估治疗效果的关键。因此，实验结束时收集小鼠肺组织，观察肿瘤转移情况。如采集的肺组织照片和 H&E 染色照片所示（图 7k)，PBS、DAC 和 TNPs 组肺转移严重，肺结节数量较多。相反，'TD@COFs + L' 组转移性结节最少。总之，这些结果表明基于 TD@COFs 的协同细胞焦亡诱导可以引发强大的全身免疫反应，以抵抗原发性肿瘤和远处肿瘤的生长以及肿瘤转移，最终延长荷瘤小鼠的生存期。![]()
图7. 激活全身抗肿瘤免疫。
3. 总结与展望
综上所述，本研究开发了一种新型纳米平台，该平台可以增强 AIEgen 的诊疗能力并实现缺氧条件下 DAC 药物的控制递送，从而增强图像引导的细胞焦亡介导的癌症免疫治疗。我们首先设计并合成了一系列具有不同数量吸电子丙二腈取代基的 DA 型 AIEgen。进一步的研究和比较表明，加入两个 A 单元可获得最长的响应区域和最有效的 PDT 效果，超过了具有一个或三个 A 基团的类似物。高性能 AIEgen 和 DAC 被封装到偶氮基缺氧响应性 COF 中，该 COF 在缺氧刺激下能够在偶氮还原酶存在下降解，从而促进 DAC 药物的控制释放。值得注意的是，AIEgen 诱导的 PDT 效应加剧了缺氧，加速了药物释放过程。更有趣的是，azo-COF可以通过PET效应抑制AIEgen的发射，并且在缺氧引发的COF降解后，荧光和PDT性质均显著改善。由于原位可激活的荧光特征，纳米剂有助于灵敏地描绘体内肿瘤。当纳米平台渗入肿瘤部位后，由于PDT疗效增强和药物控制释放的协同作用，纳米剂诱导了强大的PDT效应和肿瘤细胞的有效焦亡。由于其卓越的ROS生成能力和焦亡诱导剂的自我加速释放，该纳米剂不仅抑制了4T1肿瘤小鼠原发性肿瘤的生长，而且还阻碍了远处肿瘤的进展。这项研究为TME可激活的光诊疗和化疗系统的开发提供了宝贵的见解，促进了自我协同的癌症免疫治疗。【文章链接】
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2024.122610
【DOI号】
10.1016/j.biomaterials.2024.122610
IF = 14
