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酶是生物体重要的标志物之一，其活性或表达水平能够反映机体的健康状况。通过测量特定酶在体液中的活性或浓度，可以获得关于患者健康状况的重要线索，从而实现疾病诊断。然而，现有的生物酶检测技术和方法大都需要特定的专业设备，操作流程耗时，成本不菲。因此，开发操作简便、无需专业设备、成本低且可快速测定生物酶活性或表达水平的方法至关重要。
纳米酶的出现引发了一波研究热潮，尤其是在生物传感领域。将具有催化活性的纳米材料与比色、荧光或电化学等检测手段相结合，使得纳米酶在快速、准确检测临床生物标志物方面展现了巨大的潜力。其中，对于天然酶类标志物的检测研究大多通过待测物与纳米酶构建级联反应，即天然酶的催化产物（如H2O2）进一步作为纳米酶的催化底物，从而实现纳米酶催化体系对酶类标志物的检测。然而，这种传统检测思路限制了对大多数天然酶检测方法的研究。因此，设计新型检测策略，对酶类标志物的检测具有重要意义。
近期，长春应化所杜衍研究员及其合作者合成了一系列具有特定酶活性的纳米酶，并根据天然酶类生物标志物的特性专门定制设计了检测方案，实现了对于胱硫醚γ裂合酶（cystathionine γ-lyase，CSE）和NAD(P)H:醌氧化还原酶-1(NAD(P)H: quinone oxidoreductase-1，NQO1)的检测。相关工作分别以“A metal-organic framework-derived ruthenium-nitrogen-carbon nanozyme for versatile hydrogen sulfide and cystathionine γ-lyase activity assay”和“Innovative colorimetric NQO1 detection strategy via substrate competitive and biomimetic cascade reactions with a highly active NADH oxidase mimic”为题发表在《Biosensors and Bioelectronics》和《Analytical Chemistry》杂志上。
一、氮掺杂碳负载钌金属原子的纳米酶用于酶活性检测
利用主客体策略，选择孔径略大于金属前体直径的MOF作为主体分子，将金属前体（Ru(acac)3）限制在其中作为客体分子。通过对主客体复合物进行热处理，可形成丰富的N配位点，以充当金属中心原子的锚定位点，有助于避免金属原子在高温热解过程中的团聚现象，从而形成单原子Ru分散的Ru-N-C纳米酶。Ru-N-C纳米酶具备优异的类过氧化酶（POD）活性，可以在过氧化氢（H2O2）存在下，将显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）催化转化为蓝色的氧化产物（oxTMB）。由于硫化氢（H2S）会抑制其活性，导致蓝色产物的减少或消失，进一步实现了H2S比色检测。
图1 Ru-N-C纳米酶的制备与表征
图2 Ru-N-C纳米酶POD酶活性考察
在此基础上，进一步开发了一种肿瘤组织及细胞内CSE测定的方法。在存在辅酶5-磷酸吡哆醛（PLP）时，CSE可以催化胱硫醚的γ-消除反应，生成半胱氨酸（Cys），而半胱氨酸可以作为CSE催化的下一步反应的底物，进而产生H2S。通过将CSE催化的反应与Ru-N-C纳米酶催化的TMB显色反应相偶联，即可实现对CSE活性的比色检测。其线性范围为1到100 U/L，检测限为0.47 U/L，总检测时间约为24分钟。这种快速、简便的检测方法，体现了Ru-N-C纳米酶用于CSE活性检测的实用性和便捷性。该工作与南京大学魏辉教授共同合作完成。
图3 利用Ru-N-C纳米酶构建对于CSE的检测
二、类NADH氧化酶活性纳米酶底物竞争与级联反应用于NQO1酶检测
以Co(NO3)2作为客体分子，并通过调控其添加量，在高温碳化条件下成功合成了一种高类NADH氧化酶（NOX）活性的CoNC纳米酶，其比活性（SA）可达5.2 U/mg，显著优于已报道类NOX模拟物。鉴于其优异的类NOX酶活性，CoNC可利用氧气氧化NADH，生成NAD+和H2O2，其中H2O2可以构建后续酶级联显色反应。
图4 CoNC纳米酶的类NOX酶活性考察
NQO1是一种以NADH或NADPH为辅因子，催化醌类化合还原为氢醌类化合物的抗氧化酶，其多态性与多种疾病相关联。考虑到NADH均可以作为天然酶NQO1与CoNC纳米酶的底物被消耗，研究人员提出了一种基于底物竞争反应的方案以实现酶类标志物NQO1的检测。在该检测方案中，NADH和CoNC的用量被固定，随着NQO1的加入，直接导致CoNC催化氧化NADH量减少，进一步使得H2O2产生量减少。为了捕捉并放大这一变化，引入了具有类POD活性的普鲁士蓝(PB)纳米酶构建级联反应，有效实现了检测信号的转导和输出。得益于酶对底物的选择性，该检测方法展现出了极高的灵敏度和特异性，其检测限达到了0.67 μg/mL。由于NQO1在多种肿瘤中过度表达（5-200倍），研究人员将该方法用于检测不同类型细胞以及H2O2刺激后细胞的NQO1表达情况。结果表明，该方法可以准确响应不同细胞中NQO1表达情况，与WB分析结果相一致，充分说明了该检测方法的可靠性。该工作与东北师范大学马崇博博士共同合作完成。
图5 CoNC纳米酶用于NQO1检测示意图
图6 CoNC纳米酶检测胞内NQO1水平
