Nano Letters | 仿生表面配体工程调控金团簇酶的电子转移以提高类酶活性与传感性能

    随着纳米酶领域研究的逐渐深入，研究人员发现：与其漫无目的筛选合成，模拟天然酶的结构和催化机制是提高团簇酶催化活性的高效手段。在天然的氧化还原酶中，催化反应的发生往往伴随着电子的转移过程：电子从电子供体转移到电子受体上（即催化活性位点），进而降低底物活化能，促进催化反应的进行。事实上，MNCs类酶活性较低的主要问题在于：（1）MNCs不具备与天然酶相同的催化活性位点，（2）与金属原子紧密结合的表面配体阻碍了电子向底物分子的转移。因此，如何能在团簇上构建与天然酶相似的活性位点，同时还能促进电子由电子供体向构建的活性位点转移，则是有效提升MNCs类酶活性的关键。

    在天然的过氧化物酶（POD酶，如HRP）中，氧化还原反应主要发生在辅因子上（如血红素，其活性中心为Fe-N₄结构），在催化反应中作为电子受体。而在金属纳米团簇结构中，金属核中价电子的离域作用机制使金属核表现为富电子的特征，可将其作为电子供体。因此，受到天然酶中拥有特定化学结构的催化中心所发生的电子转移的启发，湖南大学化学化工学院李昆教授团队提出通过仿生表面配体工程调节团簇酶中电子传递的思路。将Fe-TCPP（POD酶的辅因子类似的Fe-N₄结构）通过共价作用与AuSG（谷胱甘肽保护的金纳米团簇）相结合，作为团簇酶的配体模拟天然酶的活性中心，合成了新型团簇酶AuSG-Fe-TCPP。利用金属团簇核心的富电子特性，实现了电子向构建的表面配体中活性位点Fe-N₄的转移。与AuSG相比，AuSG-Fe-TCPP表现出显著提高（39.6倍）的类POD酶活性。进一步研究表明，Fe-TCPP 不仅能模仿活性中心结构，增强了对 H₂O₂的亲和力；而且还能促进电子转移过程，实现了高效的H₂O₂活化。基于此，作者构建了基于AuSG-Fe-TCPP的比色传感体系，完成了对超声过程中产生的微量H₂O₂的准确检测，证实了仿生表面配体工程电子转移可以提高传感性能，实现更宽的线性范围和更低的检测限。该工作于2024年6月13日发表在Nano Letters期刊上，第一作者是博士研究生樊谨菘。

4.1 通过仿生表面配体工程在团簇酶表面构建天然酶的催化活性位点

    谷胱甘肽（GSH）同时作为保护配体和还原剂实现AuSG的合成，随后，采用共价结合的手段实现AuSG-Fe-TCPP的合成（图1a）。紫外−可见光谱在400 nm处的吸收证明AuSG的成功合成（图1b）。AuSG-Fe-TCPP的紫外−可见吸收光谱在410 nm和571 nm处的特征吸收峰（图1d）与Fe-TCPP的特征吸收峰（图1c）相对应，并结合红外光谱数据说明AuSG-Fe-TCPP存在酰胺键（图1e），证明了AuSG和Fe-TCPP通过共价作用实现AuSG-Fe-TCPP的成功合成。

图1 (a) AuSG-Fe-TCPP团簇酶的合成过程示意图。AuSG (b), Fe-TCPP (c)和AuSG-Fe-TCPP (d)的紫外−可见光谱。(e) GSH, AuSG, 和AuSG-Fe-TCPP的红外光谱图。 

4.2 金属核到配体活性中心的电子转移使AuSG-Fe-TCPP表现出优异的类POD酶活性

    当MNCs的电荷转移到金属离子上时，MNCs的荧光会发生猝灭。图2a的荧光光谱数据表明AuSG-Fe-TCPP的荧光强度远低于AuSG，该荧光猝灭现象说明可能存在电子由AuSG向Fe-TCPP的转移。XPS数据中，AuSG-Fe-TCPP在Au 4f的结合能高于AuSG的结合能，且AuSG-Fe-TCPP在Fe 2p2/3的结合能要低于Fe-TCPP的结合能（图2b），说明在AuSG-Fe-TCPP中存在着电子转移。因此，结合荧光光谱和XPS的结果可知，在AuSG-Fe-TCPP中实现了电子有金属核向类天然酶催化位点Fe-TCPP上的电子转移，实现了对天然酶催化机制的模拟。

    作者发现AuSG-Fe-TCPP的POD酶活性比起AuSG更为优异（图2d）。而且，含不同金属的AuSG-M-TCPP（M = H, Co, Ni, Cu, Zn）中，只有AuSG-Fe-TCPP表现出显著的类POD酶活性的提高（图2e），说明Fe-TCPP是提高催化活性关键因素。随后，KSCN作为Fe位点的封闭剂加入到AuSG-Fe-TCPP的催化反应过程中，AuSG-Fe-TCPP的类POD酶活性几乎被完全抑制（图2f），证明了Fe-N4是AuSG-Fe-TCPP中的主要催化位点。由上述结果可知，电子从MNCs的金属核向活性中心发生电子转移，因此，AuSG-Fe-TCPP表现出优异的类POD酶活性。

图2. (a) AuSG和AuSG-Fe-TCPP的荧光光谱。(b) AuSG和AuSG-Fe-TCPP的Au 4f XPS谱。(c) Fe-TCPP和AuSG-Fe-TCPP的Fe 2p2/3 XPS谱。(d) AuSG, Fe-TCPP和AuSG-Fe-TCPP类OXD酶和POD酶活性。(e) AuSG和AuSG-M-TCPP (X = H, Fe, Co, Ni, Cu, Zn)的类POD酶活性。(f) KSCN对AuSG-Fe-TCPP类POD酶活性的影响。

4.3 仿生表面配体工程增强了AuSG-Fe-TCPP对H₂O₂的亲和力

    利用Michaelis-Menten模型对AuSG和AuSG-Fe-TCPP的催化能力进行评估。结合图3a-3d，当以底物H₂O₂和ABTS为比较对象时，AuSG-Fe-TCPP的催化效率是AuSG的39.6倍和4.6倍。值得注意的是，AuSG对于H₂O₂的Km值为36.7 mM，而AuSG-Fe-TCPP对于H₂O₂的Km值仅为2.7 mM，而两者对于ABTS的Km几乎一致。Km值的不同表明AuSG-Fe-TCPP对于H₂O₂具有更强的亲和力，因此，说明AuSG-Fe-TCPP更高的类POD酶活性主要归因于Fe-TCPP的引入提高了材料对于H₂O₂的亲和力。为进一步验证，作者将AuSG和AuSG-Fe-TCPP分别与同浓度的H₂O₂孵育相同时间后，采取离子诱导的聚集手段将MNCs沉淀。利用HRP和ABTS对上清液中H₂O₂的浓度进行检测（图3e），AuSG-Fe-TCPP体系中的上清液几乎无法检测到H₂O₂（图3f），表明AuSG-Fe-TCPP对H₂O₂具有更高的亲和力。

图3. AuSG和AuSG-Fe-TCPP对底物ABTS (a)和H₂O₂ (b)的米氏动力学曲线。AuSG和AuSG-Fe-TCPP对底物ABTS (c)和H₂O₂  (d)的Km, Vmax和Vmax/Km。(e) HRP酶催化ABTS氧化的示意图。(f) 不同上清液/ABTS/HRP反应体系。

4.4 电子转移过程提高类POD酶活性的机制

    为了阐明类POD酶活性的潜在机制，首先采用电化学实验评估AuSG和AuSG-Fe-TCPP对于H₂O₂的催化能力。比起AuSG，AuSG-Fe-TCPP表现出对H₂O₂更强的还原能力，说明AuSG-Fe-TCPP能够向H₂O₂转移更多的电子（图4a、4b）。在光的激发下，AuSG和AuSG-Fe-TCPP表现出荧光发射。当激发的电子数目变少时，返回基态的电子也会相应减少，从而导致荧光强度的降低。因此，荧光强度下降的比率与AuSG和AuSG-Fe-TCPP在反应体系中的电子转移过程有关。为此，作者利用荧光光谱监测反应过程发现，当向体系中加入H₂O₂或H₂O₂和ABTS混合物后，比起AuSG，AuSG-Fe-TCPP的荧光强度下降更快（图4c、4d）。因此，在反应过程中，AuSG-Fe-TCPP能够转移更多的电子到底物上，表现出更高的催化活性。

    通常而言，类POD酶的催化过程伴随着自由基的产生，其主要为羟基自由基（^·OH）。当AuSG和AuSG-Fe-TCPP分别H₂O₂和对苯二甲酸（TA）混合反应一段时间后，AuSG-Fe-TCPP的反应体系中表现出更强的荧光强度，即荧光产物2 -羟基对苯二甲酸（图4e），说明AuSG-Fe-TCPP能够产生更多的^·OH。为进一步证明该观点，5,5 -二甲基- 1 -吡咯啉- N -氧化物（DMPO）作为捕获剂，利用电子自旋共振（ESR）光谱对产生的自由基进行分析（图4f）。在AuSG-Fe-TCPP与H₂O₂混合的体系中，可以观察到^·OH所对应的1:2:2:1的四重峰，而没有在AuSG与H₂O₂混合的体系中观察到特征峰。因此，AuSG-Fe-TCPP的高催化活性可能来自于其能够诱导H₂O₂产生更多的^·OH。

    基于以上实验，MNCs的类POD酶活性主要来自于对于H₂O₂的活化产生^·OH。Fe-N₄结构作为催化中心是AuSG-Fe-TCPP高POD酶活性的主要原因。在该结构中，电子由金属核向催化中心Fe-N₄进行转移，进而实现AuSG-Fe-TCPP向H₂O₂之间的电子转移，诱导H₂O₂均裂产生更多的^·OH用用于ABTS的氧化（图4g）。

图4. AuSG (a)和AuSG-Fe-TCPP (b)在有无H₂O₂下的循环伏安曲线。(c) AuSG和AuSG-Fe-TCPP分别与H₂O₂混合溶液的荧光光谱随时间的变化。(d) AuSG和AuSG-Fe-TCPP分别与H₂O₂和ABTS混合溶液的荧光光谱随时间的变化。(e) AuSG和AuSG-Fe-TCPP分别于H₂O₂和TA反应后的荧光光谱。(f) ESR检测AuSG和AuSG-Fe-TCPP反应体系中的^·OH。(g) AuSG和AuSG-Fe-TCPP催化氧化ABTS的机制。

4.5 基于AuSG-Fe-TCPP实现对H₂O₂的痕量检测：更低的检测限和更宽的线性范围

    实验室的超声清洗仪在超声过程中会产生痕量的H₂O₂（图5a），而产生的H₂O₂可能会影响特定的反应，因此，对该H₂O₂的检测具有重要意义。考虑到AuSG-Fe-TCPP比起AuSG对于H₂O₂具有更高的亲和力，因此，AuSG-Fe-TCPP有望实现对痕量H₂O₂的检测（图5b）。如图5c和5d所示，AuSG和AuSG-Fe-TCPP对于H₂O₂检测的线性范围分别为10−200 μM和1−200 μM，检测限分别为1.22 μM和0.64 μM。比起AuSG，AuSG-Fe-TCPP的对H₂O₂检测的线性范围低一个数量级（图5d），因此，能够更准确的检测痕量H₂O₂。作者选择了5 mL的玻璃瓶、5 mL的塑料离心管和1.5 mL塑料离心管作为容器，对其中的缓冲液超声处理30 min后，利用AuSG和AuSG-Fe-TCPP结合ABST对产的H₂O₂进行检测，在三个容器中均可以检测到H₂O₂的产生（图5e-5g）。然而，与空白对照组（无团簇酶的加入）比较，AuSG的反应体系中，其信号无明显区别，主要原因为其对H₂O₂较低的亲和力。结合图5c和5d的标准曲线，AuSG-Fe-TCPP比起AuSG具有更宽的检测范围，作者利用AuSG-Fe-TCPP实现了对超声过程中产生的H₂O₂的准确检测（图5h-5j）。

图5 (a-b) 检测实验室超声清洗仪超声过程中产生的H₂O₂示意图。(c-d) AuSG和AuSG-Fe-TCPP随H₂O₂浓度变化催化氧化ABTS的吸光度的线性关系。利用AuSG和AuSG-Fe-TCPP检测5 mL的玻璃瓶(e, h)，5 mL的塑料离心管(f, i)和1.5 mL的塑料离心管(g, j)超声过程中产生的H₂O₂。

    受到天然酶结构和催化机制的启发，作者利用配体工程在AuSG团簇酶表面构建辅因子，合成AuSG-Fe-TCPP团簇酶。与AuSG相比，AuSG-Fe-TCPP表现出优异的类POD酶活性。实验揭示了Fe-TCPP作为主要的底物结合位点和电子受体，可以提高H₂O₂的亲和力，并实现H₂O₂的高效活化。基于此，AuSG-Fe-TCPP表现出对H₂O₂更低的检测限和更宽的检测范围，从而被成功应用于痕量H₂O₂的准确检测。该研究证实了天然酶活性中心结构启发的配体工程可有效实现的团簇酶类酶活性的调控与提高。