【话险危夷】hUC-MSC-EV-miR-24 增强右美托咪定预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用

摘要

microRNAs (miRNAs)对心肌缺血-再灌注(I/R)损伤的心脏保护作用已被证实。本文主要为了解读右美托咪定(DEX)预处理后人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡(huc-msc-ev)在心肌I/R损伤中miR-24传递机制。收集鉴定人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)并从中提取细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)，并将其与DEX预处理的缺氧/复氧(H/R)心肌细胞模型共培养或注射到I/R小鼠模型中。采用分子生物学实验的方法评价心肌细胞和心肌损伤情况。miR-24在huc- msc-ev中高表达。Huc-msc-ev可以将miR-24转移到心肌细胞中，在DEX预处理后，miR-24 可以增强细胞活力，抑制细胞凋亡。在RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)与 huc-msc-ev 共培养体系中，miR-24 促进巨噬细胞m2型极化，降低 m1 型极化。在机制上，miR-24 靶向KEAP1(E3泛素连接酶接头蛋白)并抑制其表达，导致 Nrf2/HO-1信号通路中断。体内数据证实huc-msc-ev传递的miR-24增强DEX预处理对心肌I/R损伤大鼠炎症和细胞凋亡的抑制作用。综上所述，huc-msc -ev传递的miR-24可通过下调KEAP1/Nrf2/HO-1信号轴，促进巨噬细胞M2极化，增强DEX预处理对心肌 I/R损伤的保护作用。

关键词：人脐带间充质干细胞；细胞外囊泡；microRNA-24；KEAP1；缺血-再灌注损伤；Nrf2/HO-1信号通路；右美托咪定；巨噬细胞极化

引言

急性心肌梗死(AMI)是世界上导致死亡和残疾的主要原因之一。虽然再灌注治疗是防止心肌进一步坏死和保护存活细胞的合理方法，但心肌再灌注过程会造成心肌细胞损伤，即“心肌再灌注损伤”，并导致最终的心肌梗死。缺血-再灌注(I/R)损伤是一个复杂的治疗过程，与氧化应激和炎症反应等多种因素相关，可导致心肌功能障碍。右美托咪定(DEX)预处理可减轻心肌I/R损伤。心肌细胞是心脏的工作细胞，也是最容易受到 I/R 损伤的细胞。急性心肌 I/R 导致细胞凋亡、坏死和炎症反应不同程度地决定急性心肌缺血后最终心肌梗死的大小，因此调节细胞死亡和炎症反应成为心脏保护的重要治疗靶点。梗死后浸润的巨噬细胞表现出高度的表型多样性。其中，M1巨噬细胞促进炎症反应的进展，M2巨噬细胞发挥一定的抗炎作用，并通过改变其功能特征共同调节梗死周围的免疫微环境。巨噬细胞亚群可介导细胞保护和修复心肌梗死，也可通过激活心肌细胞的抗凋亡程序发挥积极作用。细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)是由异质细胞群释放的膜囊泡，包括源自内体系统或质膜的外泌体和微囊泡。EVs可以与受体细胞相互作用，转移其蛋白质、脂质和RNA的内容物。EVs 转运的microRNAs (miRNAs)被认为是肿瘤生物标志物和潜在的治疗载体，因为它们在调节包括心血管疾病在内的疾病的病理过程中发挥着重要作用。间充质干细胞衍生的EVs (MSC-EVs)可以通过其内含物miR-182改变巨噬细胞的极化状态，并通过促进M1巨噬细胞(促炎)向M2 巨噬细胞(抗炎)转化来抑制心肌损伤。有报道称，miR-24可通过调节NF-κB/TNF-α 通路预防心肌I/R损伤。miR-24-3p能够抑制受体相互作用蛋白激酶1 (Receptor-interacting protein kinase 1, RIPK1)，在心肌I/R 损伤中发挥心脏保护作用。值得一提的是在此次研究中生物信息学预测发现kelch与ECH相关蛋白 1 (KEAP1)一样是心肌 I/R损伤中 miR-24 的靶基因。有研究表明益气活血方使 KEAP1/Keap-核因子-红细胞2相关因子2 (Nrf-2)信号通路失活，可抑制心力衰竭引发的心肌细胞凋亡。Nrf-2可通过调控巨噬细胞诱导早期心肌 I/R炎症。Nrf2/血红素加氧酶-1 (HO-1)通路在心肌缺血中的关键作用也有文献记载。心肌梗死后小鼠心脏中HO-1 表达升高。鉴于上述证据，此次研究试图探索MSC-EV miR-24 在心肌 I/R 损伤中的潜在机制，并讨论巨噬细胞极化在这一过程中可能发挥的作用，其中KEAP1/Nrf-2/HO-1轴参与其中。

材料与方法

道德声明

本研究依据《赫尔辛基宣言》和美国国立卫生研究院(Bethesda, MA)发布的指南，经华南大学衡阳医学院第一附属医院临床伦理委员会批准实施。经父母同意，从婴儿身上获取人类脐带。动物实验参照华南大学衡阳医学院第一附属医院机构动物爱护委员会进行。

生物信息学

从Gene Expression Omnibus (GEO)数据库中下载微阵列数据集 GSE53211 和 GSE159814。GSE53211包括9例心肌梗死样本和 4 例健康对照样本。GSE159814 包含3个hUC- MSC样品。

hUCMSCs的表征

从婴儿身上获得新鲜脐带，用PBS洗涤两次，在4°C下去除血液。然后，将脐带分离成10mm³ 的样品，在含有0.1%透明质酸酶、I型胶原酶和3mM -CaCl的溶液中分离4小时。之后，样品在DMEM (Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham, MA)和10% FBS (Pan Biotech, Aidenbach, Germany)中孵育，在37°C含5%二氧化碳细胞培养箱中培养。每4天更新一次培养基，去除非贴壁细胞。当 hUC-MSCs 的融合度达到 80%左右时，按1:3传代。采用流式细胞术检测 CD73 (V B-CD73.3, BD Biosciences,Franklin Lakes, NJ)、CD90 (AB_395969)、CD105(AB_11154045)、CD34 (V_MA22)和CD45 (AB_647424)等表面标志物的表达，以鉴定 hUC-MSCs 的多能性。在分化的hUC-间充质干细胞中，CD73、CD90和 CD105高表达，而CD34和CD45表达较差。采用茜素红染色(ScienCell,Carlsbad, CA)检测 hUC-MSCs的成骨分化。油红O染色(上海源业生物技术有限公司)和阿利新蓝染色(上海哈灵生物技术有限公司)分别证实了脂肪分化和软骨分化。选择3-6代的细胞进行后续实验。

hUC - MSC -EVs 的分离鉴定

从hUC-MSCs中分离ev。

DEX预处理后心肌 I/R损伤小鼠模型构建

将72只雄性C57BL/6小鼠(8-10周龄，南京大学模型动物研究中心)置于无特定病原体环境中饲养。小鼠腹腔注DEX (T2524, 20µg/kg;购买自Target Mol,Boston, MA) 1 h，然后随机假手术，进行I/R建模。所有小鼠均用异氟烷汽化器麻醉，并用HX-300S动物呼吸机通气。打开小鼠左胸腔，采用8-0Prolene缝线缝合左前降支冠状动脉(LAD)，形成闭塞。局部缺血诱导30分钟后，解除结扎，小鼠再灌注60分钟，最后缝合胸腔，拔出导管，使小鼠恢复自主呼吸。实验结束后，小鼠被异氟醚过量麻醉安乐死，并收集心脏。

逆转录-定量聚合酶链反应(RT - qPCR)

用TRIzol试剂(16,096,020，赛默飞世尔科学公司)提取总RNA，然后用 Takara PrimeScript RT 主混合试剂盒(RR037B, Takara，大连，中国，用于 mRNA 检测)或TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒(4,366,596，赛默飞世尔科学公司，用于 miRNA 检测)进行反转录和定量。RT-qPCR采用 SYBR Premix Ex Taq II试剂盒(Takara, Cat No.2)，在20µL反应液中加入等量 cDNA。所有mRNA 引物如补充表1所示。

细胞转染及H/R模型构建

RAW264.7细胞(CL-0190, Procell，武汉，中国)和HL-1细胞(Cat#SCC065, Millipore, Billerica, MA)在6孔板细胞培养皿中以2 × 10⁵细胞/mL的密度培养。汇合度达到80%后使用 lipofectamine 3000试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)转染 hUC- MSCs、HL-1 细胞和RAW264.7细胞。转染后，RAW264.7 细胞与1µg/mL LPS (Sigma,St Louis, MO)反应24 h诱导极化。用 mir -24-inhibitor、inhibitor-NC、miR-24-mimic 或 np -mimic 处理hUC-MSCs。

心肌细胞和巨噬细胞内化ev

PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒(Sigma)用于标记ev。ev用试剂盒提供的0.5 mL稀释液C重悬，用 4µL PKH67 孵育4min，然后在10% FBS上加入10 mL DMEM/F12培养基停止染色。在100,000 g和4°C下离心，得到ev。

荧光素酶测定

使用GloMAX20/20光度计(Promega)在Dual荧光素酶报告基因分析系统(E1910, Promega Corporation, Madison, WI)中检测荧光素酶活性。

超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的测定

HL-1细胞用冰盐水匀浆。SOD 活性测定采用市售检测试剂盒(A001-3-2，南京建成)。采用GSH-Px活性检测试剂盒（A005-1-2，建成）检测GSH-Px活性。最后用分光光度计对样品进行分析。

细胞计数试剂盒- 8 (CCK - 8)测定

通过CCK-8(日本九州岛Dojindo)检测细胞活力，并利用微板读取器(Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA)在450 nm处测量样品的吸光度。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

采用ELISA试剂盒检测I/R小鼠心肌组织中炎症相关因子IL-6 (ab222503, Abcam)和 TNF-α (ab208348, Abcam)水平。

流式细胞术

采用Annexin v -荧光素异硫氰酸酯(FITC)细胞凋亡检测试剂盒(南京KeyGen生物科技有限公司有限公司，南京，中国)检测细胞凋亡。收获培养48 h后的细胞，用0.25%无乙二胺四乙酸胰蛋白酶处理，用500µL结合缓冲液重悬。细胞悬液用5µL annexin v - fitc 标记的特异性抗体和碘化丙啶在黑暗中染色15-20 min，之后流式细胞仪进行细胞分选，并用法西斯diva 4.1软件(BD Biosciences)分析数据。

组织学分析

细胞凋亡检测采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dutp -生物素缺口末端标记(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(C1088,Beyotime，上海，中国，绿色荧光)。

5 -氯化三苯四唑(TTC)染色

采用TTC法检测小鼠心肌梗死面积。切片在37°C水浴中用1% TTC溶液染色30分钟(黑暗条件)，在10%多聚甲醛溶液中固定24h。用滤纸干燥部分切片，从心脏顶端到底部排成一排，用索尼相机拍照。采用 ImageJ 软件对心肌梗死面积进行评估。

经胸廓的超声心动图

利用Acuson Sequoia 512彩色多普勒超声在62c-S探头(频率:8.5 mHz)的辅助下，以100 mm/s的扫描速度对小鼠心功能进行评估。连续3个心动周期测量左室舒张末期内径(LVEDD，mm)、左室收缩末期内径(LVESD，mm)、左室舒张末期容积(LVEDV，µL)、左室收缩末期容积(LVESV，µL)，并取其平均值。

免疫印迹

为了检测相关蛋白的表达，使用RIPA 裂解缓冲液(R0010，北京Solarbio科技有限公司，有限公司，北京，中国)提取细胞总蛋白，并使用 bicinchoninic 酸蛋白检测试剂盒(20201ES76, Yeasen)检测蛋白浓度。

统计分析

所有数据均采用SPSS 22.0软件(IBM Corp. Armonk, NY)进行分析，采用非配对t检验(两组)和单向方差分析(多组)。为保证实验结果的准确性，所有体外实验均至少重复3次。测量数据以均数±标准差表示。P < 0.05 为差异有统计学意义。

结果

hUCMSCs and hUCMSCEVs的表征

从临床组织样本中分离hUC-MSCs，用流式细胞术检测其表面标志物。结果显示，分离的 hUC-MSCs对CD73、CD90和CD105呈阳性，但对CD34和CD45 呈阴性(图1A)。油红O染色、茜素红染色和阿利新蓝染色结果显示，分离的 hUC-MSCs 具有成脂、成骨和软骨分化的特征(图1B)。这些结果确定了 hUC-MSCs的成功分离。然后从hUC-MSCs中分离出ev。在TEM下，分离的ev呈现明显的异质性，为圆形或椭圆形膜性囊泡，囊泡外围可见膜性结构。中心部位出现低电子密度成分(图1C)。同时，NTA 结果显示，ev具有不规则的布朗运动，直径为30-150 nm(图1D)。Western blot 结果表明，hUCMSCE对 CD63、TSG101 和 ALIX呈阳性，对内质网标志物钙连蛋白呈阴性(图1E)。

图1 hUC-MSCs和hUC-MSC-ev的表征。 A.用流式细胞术鉴定hUC-MSC表面标记物。B鉴定hUC-MSCs的分化能力，(i)使用茜素红染色分析成骨分化；（ii）通过油红O染色分析成脂分化；（iii）使用Alcian蓝染色分析软骨生成分化。C 透射电镜下ev的形态学。ev用红色箭头表示。DNTA测量hUC-msc-ev的尺寸分布。E使用Western blot分析EV表面标记物的表达。* p<0.05 vs. hUC-MSCs组。数据以平均±标准差表示。两组间的比较采用非配对t检验。这个实验重复了三次。

经DEX预处理后，hUCMSCEVs传递miR24抑制巨噬细胞M1极化和心肌细胞的凋亡

ev通过转移miRNAs在细胞通讯中发挥关键作用。此次试验从GSE53211数据集(包括 9个心肌梗死样本和4个健康对照样本)中筛选了16个与心肌梗死相关的差异表达miRNAs(图2A)，并从GSE159814数据集(图2B)中获得了3个hUC-MSC-EV 样本中显著富集的前10个miRNAs，其中miR-24 (miR-24-3p)属于两个数据集的交集(图 2C)。为了验证，首先将 pkh67标记的ev与HL-1细胞共培养48小时。共聚焦显微镜观察显示，HL-1 细胞内化了pkh67标记的ev(图 2D)。此外，在miR-24-mimic处理的hUC-MSCs和hUC-MSC-EVs中发现miR-24的表达增加，而在miR-24抑制剂处理的hUC-MSCs和hUC-MSC-ev中发现miR-24的表达下降。上述结果显示，转染miR-24-mimic或miR-24抑制剂后，hUC-MSCs和hUC-MSC-ev中miR-24的表达显著改变(补充图 1A)。在验证转染效率后，我们构建hUC-MSC-ev与 HL-1 细胞共培养体系，研究hUC-MSC-ev对HL-1细胞中miR-24表达的影响。在与hUC-MSC-ev共培养的HL-1细胞中，miR-24的表达增加。miR-24的表达在hUC-MSC-ev miR-24-mimic 的反应中显著升高;在hUC-MSC-ev存在下，miR-24的表达降低(图 2E;补充图 1B)。这些结果表明，携带miR-24的hUC-MSC-ev可以被心肌细胞内化。

如2F和补充图 1C所示，经过DEX预处理后，H/R诱导的 HL-1细胞中miR-24的表达水平比经过PBS处理的细胞低。与hUC-MSC-ev共同培养后，HL-1细胞中miR-24表达增加到与 PBS处理后相当的水平。然而用miR-24-mimic进一步治疗使miR-24表达增加，用miR-24抑制剂进一步治疗使miR-24表达下降。此外，此次实验还评估了miR-24对心肌细胞活力和凋亡的影响。DEX预处理后，H/R诱导心肌细胞活力降低，细胞凋亡增加，与hUC-MSC-ev共培养可恢复到PBS处理水平。此外，在与hUC-MSC-ev共培养的H/R诱导心肌细胞中，miR-24的过表达促进了细胞活力并抑制了细胞凋亡，而进一步抑制miR-24则导致了相反的结果(图 2G, H;补充图 1D, E)。

此外，DEX预处理后，H/R细胞中Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白表达和裂解型 caspase-3/caspase-3的比值升高，Bcl-2蛋白表达降低。hUC-MSC-ev共培养则有相反的结果。与miR-24过表达相反，额外的miR-24抑制导致Bax蛋白表达和裂解型caspase-3/ caspase-3的比例增强，而 Bcl-2蛋白表达降低(图 2I;补充图 1F)。

心肌细胞损伤与微环境中持续的慢性炎症浸润密切相关。因此，此次实验进一步研究了hUC-MSC-ev中miR-24对微环境中参与炎症浸润的巨噬细胞的影响。为了阐明传递miR-24的hUC-MSC-ev对巨噬细胞极化的调控作用，将巨噬细胞RAW264.7与hUC-MSC-ev共培养。在共聚焦显微镜下，观察到RAW264.7细胞内化pkh67标记的ev(图 2J)。此外，与hUC-MSC-ev共孵育的RAW264.7细胞中miR-24的表达增加，其作用可以通过miR-24-mimic 进一步处理而增强，但也可以通过miR-24抑制剂进一步处理而逆转(图 2K;补充图 1G)。这些结果表明，hUC-MSC-ev可以被RAW264.7细胞内化，并改变RAW264.7细胞miR-24的表达。此外还检测了iNOS (M1极化相关蛋白)和Arg-1(M2极化相关蛋白)在LPS诱导的 RAW264.7细胞中的表达。Western blot结果发现LPS诱导后的RAW264.7细胞中iNOS表达升高，Arg-1表达下降，这表明LPS可诱导巨噬细胞 M1极化，抑制M2极化。

此外，与hUC-MSC-ev共培养，RAW264.7细胞中iNOS表达降低，Arg-1表达增强，证明hUC-MSC-ev促进M2极化，抑制M1极化。与hUC-MSC-ev + miR-24-mimic 共培养的 RAW264.7细胞中，iNOS 蛋白表达降低，Arg-1 表达升高，表明巨噬细胞向M2型极化，M1型巨噬细胞极化受到抑制。相反，与hUC-MSC-ev + miR-24抑制剂共培养后，RAW264.7 细胞中iNOS蛋白表达增加，Arg-1表达受到抑制，表明巨噬细胞向M1型极化，M2型巨噬细胞极化受到抑制(图 2L;补充图1H)。

为了进一步验证，此次实验又使用流式细胞术检测了M1极化细胞表面标记物CD86和 M2极化细胞表面标记物CD206的表达。结果表明，在LPS存在时，CD86⁺CD206⁻的比例增加，而CD86⁻CD206⁺的比例降低。而hUC-MSC-ev则导致相反的结果。在LPS+EVs-miR-24模拟反应中，CD86⁺CD206⁻比例降低，而CD86⁻CD206⁺比例增加;在LPS+EVs-miR-24抑制剂的存在下则观察到相反的结果。(图 2M;补充图1I)。综上所述，这些数据表明hUC-MSC-EVs传递的miR-24抑制了DEX预处理后H/R诱导的心肌细胞凋亡，使巨噬细胞向M2表型极化，并抑制巨噬细胞向M1表型极化。

DEX预处理后，hUC-MSC-ev传递miR24减轻小鼠I/R损伤

接下来，此次实验确定了hUC-MSC-EVs传递的miR-24在DEX预处理后小鼠I/R损伤中的体内作用。RT-qPCR结果显示，在DEX预处理后，I/R小鼠心肌组织中miR-24的表达降低，这可以通过额外使用EVs-NC-mimic或ev-nc抑制剂来逆转。在DEX预处理的I/R小鼠中，EVs-miR-24-mimic进一步增加，而EVs-miR-24抑制剂降低了miR-24的表达（图3A；补充图2A)。此外，如补充表2所示，LVEDV、LVEDD、LVESV 和LVESD 增加，但DEX预处理I/R小鼠左心室缩短分数(LVEEF)和左心室射血分数(LVEFS)降低。此外，与miR-24过表达相反，进一步抑制miR-24诱导 LVEDV、LVEDD、LVESV和LVESD向上倾斜，而在LVEEF中则呈向下倾斜。

Fig2. 在DEX预处理后，huc-msc-ev传递miR-24抑制心肌细胞凋亡和M1极化，同时使巨噬细胞向M2表型极化。A.GSE53211数据集中健康对照样本（n=4）和心肌梗死样本（n=9）之间不同表达的miRNAs的热图。B.来自GSE159814数据集的前10个hUC-MSCs-EV-miRNAs的热图。C.来自两个miRNA数据集的维恩图。D.共聚焦显微镜下HL-1细胞对ev的摄取。E.RT-qPCR检测miR-24在hUC-MSCs和hUC-MSC-ev中的相对表达情况。F.RT-qPCR检测hUC-MSC-EVs单独或联合miR-24-mimic处理的HL-1细胞中miR-24的相对表达量。在HL-1细胞中建立了DEX预处理的H/R心肌细胞模型。G.使用CCK-8测量hUC-MSC-ev单独或联合miR-24-mimic处理的HL-1细胞的活力。H.流体细胞术检测hUC-msc-ev单独或联合miR-24-mime处理的HL-1细胞的凋亡。I.通过Western blot检测hUCMSC-EVs单独或联合miR-24-mimic处理的HL-1细胞中凋亡相关蛋白的表达。J.在激光共聚焦显微镜下观察RAW264.7细胞对ev的吞噬作用。K.RT-qPCR检测单独使用hUC-msc-ev或联合使用miR-24 mimic处理的RAW264.7细胞中miR- 24的表达。L. Western blot检测RAW264.7细胞中单独或联合miR-24模拟细胞中M1和M2巨噬细胞极化关键蛋白的表达变化。M通过粪便细胞术检测到，在RAW264.7细胞中，对单独或联合miR-24模拟物产生反应时，M1和M2极化细胞表面标记物的阳性率。在图中，免疫印迹，数据归一化为GAPDH表达；RT-qPCR，miR-24相对表达数据归一化为U6表达，其余基因数据归一化为GAPDH表达，相对于PBS组或DEX+PBS组。* p<0.05.数据以平均±标准差表示。两组间比较采用非配对t检验，多组数据比较采用单因素方差分析。细胞实验重复三次。

Fig3. hUC-MSC-ev传递miR-24减轻DEX预处理后小鼠心肌I/R损伤。构建了DEX预处理的I/R小鼠模型。A.通过RT-qPCR检测到hUC-MSC-EVs单独或联合miR-24 mimic处理的小鼠心肌组织中miR-24的表达。B.通过TTC染色检测hucc-msc-ev单独或联合miR-24模拟物反应的小鼠心肌梗死大小。梗死面积为白色，活心肌为红色。使用Image J软件评估梗死面积（n=5）。C. HE和Masson三色染色分析小鼠对hUC-msc-ev单独或联合miR-24模拟物的心肌损伤和磨损程度。马森三色染色，心肌胶原染色呈蓝色，心肌染色呈红色。D.小鼠心肌组织中对单独或联合miR-24 mimic有反应的TUNEL阳性细胞。E. ELISA检测msc-ev单独或联合miR-24模拟物对小鼠心肌组织中SOD活性。F.通过ELISA检测对hUCMSC-ev单独或联合miR-24模拟物反应的小鼠心肌组织中GSH-Px的活性。G. ELISA检测hUC-MSC-ev单独或联合miR-24模拟物后小鼠心肌组织中IL-6和TNF-α的表达。在图中，对于RT-qPCR，miR-24相对表达的数据被归一化为U6表达，并相对于DEX+Sham组。* p<0.05 vs.假手术小鼠。#p<0.05 vs I/R小鼠和p<为0.05 vs用ev-nc-mimic处理的I/R小鼠。数据以平均±标准差表示。两组间比较采用非配对t检验，多组资料比较采用单因素方差分析。n=8只小鼠。

FIg4. KEAP1是miR-24的直接靶点。A.TargetScan和miRmap数据库预测的miR-24靶基因和基因卡数据库中获得的前500个心肌I/R损伤相关基因的维恩图。B.RT-qPCR检测DEX预处理后H/R诱导细胞中KEAP1的表达。C.Western blot检测DEX预处理后H/R诱导细胞中KEAP1蛋白的表达。D.通过TargetScan预测miR-24和KEAP1之间的特异性结合位点。E .miR-24与KEAP1的结合通过双荧光素酶报告基因实验验证。F.通过RT-qPCR检测转染NC-mimic或miR- 24-mimic的HL-1心肌细胞中KEAP1的表达。G.Western blot检测转染ncmi或mir-24mii的HL-1心肌细胞中KEAP1的蛋白表达。在图中，对于RT-qPCR，Keap1相对表达数据归一化为GAPDH表达，并相对于nc模拟组；对于双荧光素酶报告分析，相对荧光素酶活性数据归一化为肾素酶活性和相对于nc模拟组。* p<0.05.数据以平均±标准差表示。两组间比较采用非配对t检验，多组资料比较采用单因素方差分析。细胞实验重复三次。

此外，TCC染色分析显示，DEX预处理的I/R小鼠心肌组织梗死面积增大，而hUC-MSC-EV的存在可以逆转此结果。EV-miR-24-mimic治疗减少了DEX预处理I/R小鼠心肌组织的梗死面积，而在没有miR-24的情况下发现了相反的结果。（图3B；补充图2B)。

HE染色和Masson三色染色结果显示，hUC-MSC-EV可减轻DEX预处理I/R小鼠的心肌组织损伤和心肌纤维胶原沉积，miR-24过表达可增强其作用，而miR-24抑制可逆转其作用(图 3C;补充图 2C)。此外，hUC-MSC-EV处理可抑制DEX预处理 I/R小鼠心肌组织细胞凋亡;miR-24过表达抑制了细胞凋亡，而miR-24 进一步的抑制触发了细胞凋亡(图 3D;补充图 2D)。

同时，通过ELISA检测发现，在I/R小鼠心肌组织中，SOD和GSH-Px 活性增强，IL-6和 TNF-α表达受到抑制，miR-24的过表达进一步增强了上述趋势，而敲除miR-24的结果则截然相反（图3E-G；补充图2E-G)。综上所述，经DEX预处理后，hUC-MSC-EVs传递的miR-24可抑制I/R诱导的炎症和心肌细胞凋亡，减轻心肌细胞损伤，提高SOD和GSH-Px的活性，从而改善DEX预处理后的心肌I/R损伤。

miR-24靶向KEAP1并抑制其表达

随后，此次研究试图分析在DEX预处理条件下，miR-24在心肌I/R损伤中的下游机制。通过TargetScan和miRmap数据库对miR-24的靶基因进行预测，得到与GeneCards数据库中获得的与心肌I/R损伤相关的前500个基因的交集，共获得12个候选基因（图4A）。近期研究表明，miR-24靶向KEAP1基因参与心肌I/R损伤的过程。研究发现，在DEX预处理的H/R诱导的细胞中，KEAP1的表达增加（图4B，C）。TargetScan 数据库预测 KEAP1 的 3'UTR 中存在 miR-24 结合位点(图4D)。荧光素酶检测结果进一步显示，miR-24 过表达后，KEAP1-3'UTR-WT 的荧光素酶活性降低，而 KEAP1-3'UTR-MUT 的荧光素酶活性没有变化(图 4E)。在用miR-24-mimic处理的HL-1细胞中，KEAP1的表达下调（图4F，G）。这些结果表明，miR-24可以靶向KEAP1并抑制KEAP1的表达。

miR-24通过 KEAP1/Nrf2/HO-1信号传导抑制心肌细胞凋亡和巨噬细胞 M1极化

有研究表明，KEAP1可激活Nrf2/HO-1信号通路，加重心肌I/R损伤。同时，上述miR-24 可以结合 KEAP1的3'UTR的结果使得可以合理推测hUC-MSC-EV传递的miR-24可能通过靶向KEAP1调控Nrf2/ HO-1信号通路。为了进一步明确 KEAP1在miR -24调控的心肌细胞凋亡和M1巨噬细胞极化中的作用，此次研究设计了两个靶向KEAP1的shRNA 序列，并使用RT-qPCR测定其沉默效率。sh-KEAP1-1表现出优异的沉默效率(补充图 3A, B)，因此用于后续实验。此外，Western blot结果显示，在 HL-1和RAW264.7过表达miR-24的细胞中，KEAP1、Nrf2和HO-1蛋白的表达下降，这可以通过额外的过表达处理来逆转(1)-KEAP1。此外，在转染miR-24抑制剂的HL-1及RAW264.7 细胞中，KEAP1、Nrf2和 HO-1 蛋白的表达增强，sh-KEAP1进一步处理可消除其作用(图 5A，补充图3C)。这一结果表明miR-24可以靶向KEAP1，降低其表达，下调Nrf2/HO-1信号通路。为了确定 miR-24/KEAP1/Nrf2/HO-1 轴在心肌 I/R 损伤中的作用，此次研究设计了两个靶向Nrf2 sh-Nrf2-1和sh-Nrf2-2的siRNA序列。RT-qPCR Western blot 数据显示，sh-Nrf2-1 具有较好的沉默效率(补充图 3D, E)。然后使用流式细胞术评估Nrf2对H/R暴露的 HL-1 细胞凋亡的影响。结果显示，Nrf2 过表达可增加 H/ R暴露的 HL-1 细胞的凋亡率，而miR-24过表达可消除这种作用。与单独过表达的miR-24相比，联合Nrf2过表达可使 HL-1 细胞的凋亡率更高。此外，沉默Nrf2后，HL-1 细胞的凋亡率受到抑制，而沉默Nrf2后，细胞凋亡率升高miR-24抑制。与单独沉默miR-24相比，同时沉默miR-24和Nrf2 导致细胞凋亡率降低(图 5B;补充图 3F)。Western blot结果显示，过表达Nrf2后，促凋亡蛋白Bax和 cleaved caspase-3表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低;相反，miR-24过表达会抵消Nrf2过表达的影响。此外，Bax和cleaved caspase-3 的蛋白表达受到限制，而Bcl-2在Nrf2沉默后表达上调。然而，miR-24抑制则导致相反的结果。与单独抑制miR-24相比，miR-24和Nrf2 的双重抑制导致Bax和cleaved caspase-3表达升高，Bcl-2表达降低(图 5C;补充图 3G)。

接下来又研究了RAW264.7 细胞中巨噬细胞M和M2极化分子指标及蛋白水平的变化。很明显，在LPS处理过表达Nrf2的RAW264.7细胞中，M1极化蛋白 iNOS 增加，M2极化蛋白Arg-1减少，这种作用被miR-24 过表达逆转。此外，Nrf2沉默后，iNOS表达降低，Arg-1表达增加，而miR-24 沉默则消除了这种影响。此外，同时沉默 miR-24和Nrf2恢复了 Nrf2沉默对两种蛋白表达的影响(图 5D;补充图 3H)。此外，我们进行了流动测定巨噬细胞表面分子CD86和CD206的阳性率。结果显示，过表达Nrf2后，CD86⁺CD206⁻细胞增加，CD86⁻CD206⁺细胞减少，其作用通过过表达miR-24来恢复。此外，同时过表达miR-24和Nrf2也恢复了Nrf2过表达的作用。在缺乏Nrf2的情况下，CD86⁺CD206⁻细胞减少，CD86₋CD206⁺细胞增加，而这些结果被miR-24抑制所破坏。然而，miR-24和Nrf2的双重抑制恢复了单独抑制Nrf2的效果(图 5E;补充图3I)。综上所述，miR-24可以通过抑制KEAP1的表达下调 Nrf2/HO-1信号通路的活性，从而减少H/R引起的M1巨噬细胞极化和心肌细胞凋亡。

讨论

在急性I/R损伤模型中，许多治疗方法已经被尝试并证明具有很强的心脏保护作用。然而，临床应用中的效果仍不尽人意。主要原因是I/R损伤是多因素的，通过多种机制导致心肌细胞死亡。本研究通过多种方式调整心肌损伤相关因素，以达到保护心功能的目的。综上所述，研究证实经过 DEX预处理后，hUC-MSC-EVs能有效抑制心肌损伤，促进I/R后心肌功能恢复。hUC-MSC-EVs主要抑制心肌细胞凋亡和炎症，抑制巨噬细胞M1极化，促进巨噬细胞 M2极化，发挥其保护作用。同时，研究还发现hUC-MSC-EVs传递的靶向KEAP1的miR-24可以下调Nrf2/HO-1通路，改善DEX预处理后心肌I/R损伤。

最初的结果显示I/R损伤后miR-24表达降低，并且miR-24在hUC-MSC-EVs处理的心肌细胞中呈高表达。此外，hUC-MSC-EVs中的miR-24抑制DEX预处理后的心肌细胞凋亡和炎症反应，参与巨噬细胞极化。大量研究表明DEX预处理可以改善I/R心脏的心功能，减少心肌梗死。同样，在其他已发表的研究表明在AMI小鼠模型中，miR-24可以抑制心肌细胞凋亡，减少梗死面积，改善心功能障碍。此外，已有研究表明，miR-24 可通过调控 NF-κB/TNF-α途径预防心肌I/R损伤。这些报道也可以支持此次研究中关于miR-24对心肌 I/R损伤的保护作用的发现。

在接下来的研究中还发现miR-24可以靶向KEAP1，KEAP1参与Nrf2/HO-1通路的激活，从而促进心肌细胞凋亡、炎症反应以及巨噬细胞 M2 极化。此外，hUC-MSC-EVs传递的miR-24可通过下调KEAP1表达抑制Nrf2/HO-1信号通路，从而抑制心肌细胞凋亡和巨噬细胞M1极化。miR调控Nrf2 已被认为是调节I/R损伤的重要途径。而KEAP1能够调控Nrf2活性。更重要的是，KEAP1/ Nrf2系统已被广泛用于开发蛋白-蛋白相互作用抑制剂，以稳定Nrf2。有趣的是，益气活血方灭活KEAP1/Nrf2 信号通路可抑制心力衰竭引起的心肌细胞凋亡。此外，右美托咪定下调HO-1有助于改善脓毒症引发的心肌细胞损伤。然而，这些报道未能探讨KEAP1/Nrf2/HO-1轴的上游miR调控机制。

MSC-EVs在心脏功能的调节中起着重要作用，此次研究也证实了miRNA 的转移主要是通过MSC-EVs进行的。例如，含有miR-125b-5p MSC衍生的外泌体通过抑制细胞自噬和死亡以及下调p53-Bnip3信号转导来减少梗死面积和凋亡，从而改善心脏功能。此外，MSC来源的外泌体参与巨噬细胞免疫调节和心肌 I/R 损伤后的心脏损伤修复，并且其通过 miR-182改变小鼠巨噬细胞极化。本研究通过建立小鼠心肌 I/R损伤模型，在体内验证了含有miR-24的ev对心肌 I/R损伤的影响。hUC-MSC-EVs中miR-24抑制炎症和凋亡，抑制巨噬细胞 M1 型极化，减轻心肌细胞损伤和纤维化程度。

综上所述，miR-24可以通过hUC-MSC-EVs转移到心肌细胞中，miR-24增强了DEX预处理对细胞凋亡的抑制作用和对细胞活力的促进作用。此外，通过hUC-MSC-EVs穿梭的miR-24可以促进巨噬细胞的M2型极化，抑制M1型巨噬细胞极化。由此可见，DEX 预处理增强了对心肌I/R损伤的缓解作用。其机制与KEAP1/Nrf2/HO-1信号通路的破坏有关。本研究进一步阐明了心肌I/R损伤的发病机制，为心肌 I/R损伤的治疗奠定了理论基础。为了进一步证实上述结果，还需要进一步研究DEX如何特异性作用于 KEAP1/Nrf2/ HO-1信号通路。

原始文献

Hou, Z, Yang, F, Chen, K, et al. hUC-MSC-EV-miR-24 enhances the protective effect of dexmedetomidine preconditioning against myocardial ischemia-reperfusion injury through the KEAP1/Nrf2/HO-1 signaling. DRUG DELIV TRANSL RE. 2023; 14 (1): 143-157. doi: 10.1007/s13346-023-01388-7