龚睿1 王乐2 龙刚宇1 汪茜1 姚尚龙3 尚游1 张定宇1
1华中科技大学同济医学院附属协和医院重症医学科，武汉 430021；2中国人民解放军95829部队医院重症医学科，武汉 430014；3华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科，武汉 430021
国际麻醉学与复苏杂志,2024,45(11):1141-1150 .
DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20240710‑01148
基金项目
湖北省科技创新计划重点研发项目（2023BCB091）
ORIGINAL ARTICLES
【论著】
本研究通过内毒素（LPS）气道注射构建急性呼吸窘迫综合征（ARDS）小鼠模型，应用转录组学和蛋白质组学对小鼠肺组织和血清进行测序并进行联合分析，挖掘能反映肺组织病理变化的血清生物标志物。
1 材料与方法
采用随机数字表法将40只SPF级健康C57BL/6小鼠分为2组：对照组（Control组，19只）和ARDS实验组（LPS组，21只）。LPS组小鼠给予LPS气道注射，Control组小鼠经气道注射等体积的生理盐水。
模型构建后24 h，将两组小鼠麻醉后处死，取肺组织进行苏木精‑伊红（H‑E）染色和湿/干重比（W/D）检测评估ARDS疾病模型；另外对Control组和LPS组小鼠肺组织分别进行转录组学和蛋白质组学测序，并对两组小鼠的血清进行蛋白质组学测序，然后将上述测序数据与本课题组前期关于新型冠状病毒感染（COVID‑19）导致的ARDS患者的血清和肺组织蛋白质组学数据进行联合分析，以筛选与肺组织病理蛋白变化一致的血清蛋白标志物。
2 结 果
2.1 LPS诱导ARDS小鼠模型的评估
肺组织H‑E染色显示，LPS组肺组织结构破坏明显，肺泡壁增厚和肺泡腔塌陷。与Control组比较，LPS组肺损伤评分和W/D增加（均P<0.05）。LPS诱导的ARDS小鼠模型构建成功。
2.2 小鼠肺组织转录组学特征
对Control组和LPS组的肺组织进行转录组学测序。转录组学测序数据质量评估显示，转录本FPKM密度分布、组内样品之间重复性、组间基因表达特征均符合要求（图2），提示测序数据可用于后续分析。
相对于Control组，LPS组小鼠肺组织中共有2 495个基因表达发生显著变化，其中上调的DEG有1 290个，下调的DEG有1 205个。在表达上调的DEG中按变化倍数递减排序，前100个DEG热图显示，两组间的基因表达模式有差异。见图3。
2.3 小鼠肺组织蛋白质组学特征
对Control组和LPS组小鼠的肺组织进行蛋白质组学测序，蛋白质组学测序数据质量评估显示，肺组织质谱测序的肽段长度分布、肽段漏切位点、蛋白质组学测序数据在主成分分析（PCA）图上的分布及定量蛋白相关系数均在合理范围内（图4），可用于后续分析。
基于DEP的筛选条件，共有504个蛋白质在LPS组小鼠肺组织表现出差异，包括376个上调的DEP和128个下调的DEP（图5Ⓐ、Ⓑ）。热图显示，两组间的蛋白表达模式有差异（图5Ⓒ）。
2.4 小鼠肺组织转录组学及蛋白组学联合分析
2.4.1 共同表达趋势因子的筛选
探究DEG与DEP之间的相关性，如图6Ⓐ所示，DEP与DEG变化趋势较为一致，但也存在一些分子在转录和蛋白水平上变化趋势不同。随后，通过对蛋白质组学‑转录组学测序数据进行关联后，筛选出了具有共同表达趋势的DEM共239个（图6Ⓑ），其中上调202个，下调37个。
2.4.2 共同表达趋势因子的富集分析
对239个DEM进行GO注释分析，结果显示这些DEM主要与免疫反应、炎症因子产生、炎症细胞信号转导等相关。KEGG分析表明DEM主要富集于炎症反应，NOD样受体信号通路，中性粒细胞胞外陷阱形成等通路（图7）
2.5 小鼠血清蛋白质组学表达特征分析
对Control组和LPS组小鼠血清进行蛋白质组学测序，测序数据质量评估显示，数据符合质控要求，可用于后续分析（图8）。
进一步分析了肺源性ARDS小鼠的血清蛋白质组学测序数据。在ARDS小鼠的血清中，有368种蛋白质存在显著差异，包括281种上调的DEP和87种下调的DEP（图9）。
2.6 转录组学联合蛋白质组学测序探究ARDS小鼠肺组织及血清变化趋势一致的生物标志物
将肺组织中239个DEM和血清中368个DEP进行联合分析，共发现28个共同的差异表达蛋白（CM‑DEP）在ARDS小鼠肺组织及血清中变化趋势一致，其中上调的有26个，下调的有2个（表1）
2.7 探究CM‑DEP在ARDS患者中的临床价值
为了验证CM‑DEP在ARDS患者中的临床价值，我们将28个鼠源CM‑DEP进行转换，得到23个人类同源蛋白（HHP），其中包括21个上调蛋白和2个下调蛋白。我们将23个HHP与本课题组前期发表的与COVID‑19相关ARDS患者肺组织中具有表达差异的796个蛋白取交集，最终得到11个交集蛋白（图10）。
随后，基于课题组已发表的COVID‑19相关ARDS患者血浆蛋白质组学测序数据，对11个候选蛋白在22例因COVID‑19诱发不同病情程度的ARDS患者（包括5例死亡患者、7例重症患者、10例轻度患者）和8例健康受试者的血浆中的表达水平进行验证。结果表明，与健康受试者比较，结合珠蛋白（HP）、S100钙结合蛋白A9（S100A9）、血清淀粉样蛋白A1（SAA1）和血清淀粉样蛋白A2（SAA2）蛋白水平在COVID‑19相关ARDS患者血浆中升高，并随着ARDS病情严重程度的增加而递增。见图11。
3 讨 论
本研究通过LPS气道注射建立ARDS小鼠模型，对其肺组织进行转录组学和蛋白质组学测序，分别鉴定出2 495个DEG和504个DEP，将肺组织蛋白质组学‑转录组学数据进行关联后，共筛选出了239个DEM，其中显著上调的DEM有202个，显著下调的DEM有37个，对这些DEM功能富集分析发现，这些DEM主要与炎症反应、NOD样受体信号通路、中性粒细胞胞外陷阱形成、炎症细胞信号转导等相关。同时，我们从小鼠血清样品中共鉴定出368个DEP，对肺组织和血清蛋白质组学测序结果进行表达趋势分析，确定了28个具有共同表达趋势变化的DEP（CM‑DEP）。
为了进一步探讨这些CM‑DEP在ARDS患者中的临床价值，我们将28个CM‑DEP转换成23个HHP。根据本课题组已发表的ARDS患者（COVID‑19相关）的肺组织和血浆蛋白质组学测序数据，最终筛选鉴定出在ARDS患者肺组织中具有表达差异的11个蛋白。随后，基于本课题组已发表的ARDS患者血浆数据，鉴定出4个蛋白（HP、S100A9、SAA1和SAA2）与病情严重程度呈正相关，并且这些蛋白的升高往往预示着ARDS患者的不良预后，提示4个候选蛋白有潜力成为能反映ARDS肺组织病理变化的血清生物标志物。
尽管本研究发现4个候选蛋白在COVID‑19所导致的ARDS患者中显示出良好的临床价值，但它们在其他病因所导致的ARDS中的临床价值尚不确定，不仅需要更大规模的临床队列来进行验证，还需要通过基础实验探索关键的血清蛋白在ARDS致病机制中的潜在作用。
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国际麻醉学与复苏杂志
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