研究背景
肠道黏膜是一种动态的屏障组织，它允许营养物质的吸收，为共生微生物群提供相互作用的表面，并防止系统性病原体入侵。肠道上皮细胞通过粘附和紧密连接相连，形成一个具有足够通透性的有序单层。所有肠道上皮细胞在其顶端表面表达不同类型的高度糖基化的跨膜黏蛋白，共同形成上皮糖萼。在小肠中，黏液层相对较薄，以允许营养物质的吸收，而大肠的黏液层由一个无菌的内层黏液层和一个更开放的外层黏液层组成，共生微生物群居住并在此层上以黏蛋白糖苷为食。病原体细菌已经进化出如鞭毛和粘附素等毒力因子，以穿透黏液层并侵入上皮。黏液层在肠道健康中扮演着重要角色，这从炎症性肠病中观察到的变化中可以看出。在活动性疾病期间，杯状细胞的数量和MUC2的合成、分泌或硫酸化可能会减少，导致上皮层更多地暴露于有毒物质和病原体。在溃疡性结肠炎中，黏液层比健康个体薄，而在克罗恩病中，黏液层的质量发生了变化，抗菌物质也更少。
体内或体外模型可用于研究黏液层的功能，但这些系统可能难以操作，并且不总是能够产生可复制的黏液产生。包括黏液层的体外肠道细胞培养也证明难以开发，无论是细胞系还是原代培养模型。有报道称人类肠类器官和结肠类器官具有良好的MUC2产生能力，以及具有功能性黏液层的人类肠道芯片原代培养。这些培养也可用于研究细菌-黏液相互作用，例如与肠集聚性大肠杆菌或肠出血性大肠杆菌，或在厌氧条件下使用封闭的Transwells。在原代肠道材料中，先前已经证明空气-液体界面（ALI）培养和添加肠血管活性肽（VIP）可以增强黏液产生。Transwell培养系统允许操纵顶部和基底室，允许ALI和液-液界面（LLI）培养。在ALI培养中，细胞被播种并在Transwell膜上培养至共轭，上部室的培养基被移除，使上皮层在顶端暴露于空气，在基底侧暴露于液体和营养物质，与LLI培养相比，更接近体内情况。先前已经指出，ALI模型更适合模拟黏液特性。
该研究使用了广泛使用的肠道Caco-2细胞系作为起点，研究了ALI培养和VIP对黏液产生和上皮屏障特性的影响，证明了ALI-VIP培养条件导致产生由分泌型和跨膜黏蛋白组成的黏液层。在ALI-VIP条件下，紧密连接的表达发生了变化，导致对小分子的通透性增加。共生和致病细菌与黏液层展示了独特的相互作用。总之，我们的ALI-VIP Caco-2肠道黏膜模型易于培养且稳健。此外，它适合研究黏膜在微生物-宿主相互作用、营养物质和药物吸收中的功能，并评估肠道上皮屏障特性。
研究内容
本研究探讨了在不同培养条件下，Caco-2细胞产生粘液层的情况，以及这些条件对上皮屏障特性的影响。
1 在空气-液体界面（ALI）和肠血管活性肽（VIP）联合培养条件下，Caco-2细胞能够产生粘液层。与液体-液体界面（LLI）培养条件相比，ALI条件下的Caco-2细胞形成了更厚的多细胞层。
2 通过免疫荧光显微镜观察到，在ALI-VIP条件下，Caco-2细胞顶部显著表达分泌型肠道粘液蛋白MUC2和糖蛋白结合凝集素Jacalin（JAC），表明细胞上方形成了粘液层。
3 qRT-PCR分析证实，在ALI-VIP条件下，MUC2基因表达显著上调。
4 使用微绒毛标记蛋白vilin染色，发现在LLI和ALI培养条件下的Caco-2细胞层中均可检测到vilin阳性染色，表明形成了顶端微绒毛边缘。
5 通过免疫印迹分析，发现在ALI-VIP培养条件下的细胞培养上清中存在大量的O-糖基化物质，表明粘液蛋白被分泌。
6 RNA测序分析显示，不同培养条件对Caco-2细胞的转录组有显著影响。与LLI-NT条件相比，ALI-VIP条件下有452个差异表达基因。
7 基因集富集分析（GSEA）显示，ALI-VIP条件下与细胞过程、糖蛋白生物合成过程以及与细胞外基质和顶端及基底膜相关的进程显著改变。
8在ALI-VIP条件下，多个粘液基因（包括MUC1、MUC2、MUC3A、MUC5AC、MUC12、MUC13和MUC17）表达显著上调。
9 在ALI-VIP条件下，紧密连接蛋白（如occludin、claudin-1、claudin-4和ZO-1）的表达发生改变，导致对小分子的通透性增加。
10 跨上皮电阻（TEER）实验显示，ALI-VIP条件下的Caco-2细胞电阻显著降低，表明上皮屏障功能受损。
研究还探讨了共生菌和致病菌与粘液层及下层上皮的相互作用。在ALI-VIP条件下，Caco-2细胞与粘液层的相互作用更为明显，而侵入性细菌如沙门氏菌能够穿过粘液层。该Caco-2粘液模型可用于研究共生和致病细菌与肠道粘液层的相互作用，为研究细菌与宿主互作提供了一个具有生物模拟特征的平台。
图文赏析
图1：结合空气-液体界面（ALI）和VIP处理刺激Caco-2 Transwell培养中的粘液产生。
图2：ALI-VIP条件在肠道芯片模型中诱导MUC2产生。
结论与意义：
通讯作者
Dr. K. (Karin) Strijbis，乌特勒支大学副教授，兽医医学，生物分子健康科学系，传染病与免疫学，重点研究领域：致病和共生细菌（例如沙门氏菌、绿脓杆菌、普雷沃特氏菌属、曼海姆菌、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、乳酸菌、双歧杆菌等），炎症性肠病期间粘液层的变化，粘液蛋白和细菌诱导炎症在癌变过程中的功能。先进的原发性肠道、呼吸道和阴道感染模型。
Dr. Yvonne Vercoulen是乌特勒支大学医学中心分子医学中心的助理教授，研究方向：免疫细胞如何脱轨并促进自身免疫和癌症等疾病。
