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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）通过产生耐高温和耐酸的肠毒素而导致食物中毒，是最常见的食源性致病菌之一。由于S. aureus对高温、高盐等条件具有一定耐受能力，因此常规灭菌手段难以清除。最近，越来越多的数据表明，光动力灭活（PDI）是一种有前景的冷杀菌技术，可以抑制细菌、霉菌、病毒和寄生虫等多种微生物生长。姜黄素分子本身具有抗菌活性，但是，由于ROS半衰期短，光敏剂需尽可能接近目标细胞，从而对细胞产生破坏性损伤。然而在混合液中有约90%的姜黄素不能与细菌结合处于游离状态，导致姜黄素产生的ROS利用度极低。
为改善上述问题，河北农业大学食品科技学院的张鹏敏、王文秀、马倩云*等拟利用壳聚糖作为连接细菌和姜黄素的纽带，增强姜黄素和细菌的结合能力。本研究制备的壳聚糖/姜黄素抗菌膜具有黑暗/光照双重抗菌性能。在实际应用中，亟需快速高效灭菌时，可采用光照处理加速灭菌过程。为了达到上述目的，本研究首先重点考察了壳聚糖/姜黄素双重抗菌涂膜对S. aureus的抑制效果，并从细胞结构和分子层面揭示其抑菌机理，旨在为新型冷杀菌技术在食品安全领域中的应用奠定理论基础。![]()
通过绘制细菌生长曲线研究光动力涂膜对S.aureus的抑制作用。如图1A所示，CCs/dark、Cs组与KB组相比延滞期延长16 h，可能是壳聚糖分子水解肽聚糖、破坏细菌细胞壁结构、抑制细菌生长引起的。而CCs/light延滞期长达28 h，说明光动力涂膜与无光照涂膜相比抑菌效果更明显。该对比结果表明，PDI是一种高效的抗菌技术，未来在控制S. aureus食源性污染方向有巨大应用潜力。
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进一步对比了在无光照和光照条件下，不同涂膜处理后S.aureus的菌落总数，用于分析蓝光和壳聚糖对光动力涂膜抑菌效果的影响。图1B是不同溶液处理后的S.aureus菌落总数。数据显示，KB/light组与KB/dark组相比，菌落总数下降0.31（lg（CFU/mL））。这说明仅蓝光处理可以影响S. aureus的生长，但是不能有效抑制细菌繁殖。这主要与蓝光照射能分解S. aureus表面的肠毒素，降低细菌生长繁殖能力相关。Curs/light与Curs/dark相比，菌落总数下降了1.5（lg（CFU/mL））；而Cs/light与Cs/dark相比，菌落总数下降了1.13（lg（CFU/mL））。因为PDI处理产生的ROS有抑菌作用，但是由于姜黄素和细菌结合松散和ROS寿命短等缺点，不能有效发挥ROS的抑菌作用。而Curs/light、CCs/light与KB/dark相比，菌落总数分别下降了4.65、6.89（lg（CFU/mL）），说明壳聚糖促进了姜黄素和细菌的结合，增加了ROS利用率。由此可得，壳聚糖在PDI处理过程中发挥重要作用。同时根据图1结果可知，壳聚糖/姜黄素光动力涂膜抑菌过程中起抑菌作用的因素按抑制效果大小排列依次是：ROS＞壳聚糖＞姜黄素＞蓝光。图1C为姜黄素质量浓度对S. aureus抑制效果的影响，与KB组相比，S. aureus经PDI处理后菌落总数明显减少（P＜0.05），并且姜黄素质量浓度每增加5 mg/mL，S. aureus菌落总数会下降1～1.5（lg（CFU/mL））。因此，姜黄素质量浓度是影响PDI抑菌效果的重要因素。当姜黄素质量浓度达到25 mg/L时，没有观察到S. aureus菌落。有研究中无光照条件下清除3（lg（CFU/mL））的S. aureus需要姜黄素质量浓度达到39 mg/L。本研究与之相比，姜黄素质量浓度降低了14 mg/L。这一结果说明PDI处理抑菌效果更好，在姜黄素低质量浓度下就可以达到明显的抑菌效果。如图1D所示，光照1 min的菌悬液与无光照组相比，S. aureus菌落总数下降了1.81（lg（CFU/mL））。随着光照时间的延长，S. aureus菌落总数显著下降（P＜0.05）。这说明延长光照时间可以增强PDI处理对S. aureus的抑制作用。另外，对光照时间和姜黄素质量浓度作方差分析，发现光照时间对S. aureus的抑制作用影响大于姜黄素质量浓度。随着光照时间继续延长（7～10 min），菌落总数变化不明显。这一结果说明过长的光照时间对抑菌效果无促进作用。PDI处理时要避免长时间光照。
由图2可知，不同时间光动力处理后，仅姜黄素孵育的S. aureus有89.8%是活细胞。这说明仅姜黄素处理能影响细菌生长，但是不能完全杀死细胞。PDI处理后，活细胞数量明显减少；同时随着处理时间延长，处于活的非可培养（VBNC）状态的细胞数量逐渐增加。当光照时间为3 min时，处于VBNC状态的细胞达到36.2%。随着处理时间继续延长，VBNC状态的细胞数量减少，死亡细胞逐渐增多。这说明PDI处理短时间内会促进细菌进入VBNC状态，而适当延长PDI处理时间可以有效杀灭细菌。
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与PDI处理相似，脉冲电场、紫外辐照等多种抗菌方法均会诱导细胞进入VBNC状态，而且S. aureus进入VBNC状态与氧化胁迫和ATP含量下降相关。尽管VBNC状态的细菌处于休眠状态，但它们仍然生成毒素。因此，必须在杀菌过程中清除VBNC状态的细菌。以上结果表明，PDI有清除细菌VBNC状态的能力。
由图3可知，仅光照处理，细菌细胞内仅有少量ROS产生；无光照处理组（Curs0），发现微量绿色荧光，原因可能是S. aureus为抵抗姜黄素影响，细胞产生内源性ROS，随着光照时间延长，细胞内ROS含量呈先增多后减少的趋势，ROS含量在光照3 min时最高。外源性ROS进入细胞内部，而兼性厌氧菌体内含有SOD和POD等抗氧化酶，因此细胞本身具有ROS耐受性，少量ROS不会严重影响细胞活性。随着光照时间延长，ROS含量超出细菌耐受极限，防御系统崩溃，致使细胞死亡，荧光强度下降。
结合图2结果可得：随光照时间延长，ROS产量逐渐增多，攻击细胞；同时细胞内ROS含量升高，大量细胞进入VBNC状态；当ROS产生量超出细胞耐受极限时，ROS杀死处于VBNC状态的细胞，细菌生命活性下降，表现为荧光强度降低。因此，PDI是一个损伤逐渐积累的过程，只有ROS达到一定程度才能起到杀死细菌的作用。
图4为流式细胞仪对不同光照时间下S. aureus细胞形态的检测结果。理论上FSC与细胞大小有关，SSC与细胞膜、细胞质、细胞核膜有关。随着光照时间延长，中心区域不再集中，向左下和右上扩散，表现为细胞形态发生变化，大小不均，内容物含量差异增加。这说明PDI处理改变细胞形态，破坏细胞膜结构，导致细胞物质运输受阻和细胞内容物泄漏。这可能会导致部分细胞不能向外运输物质，细胞增大；也可能导致细胞内外渗透压失去平衡，发生细胞皱缩现象。细胞SSC和FSC信号变小，说明ROS致使部分细菌细胞膜破裂形成细小碎片，并伴有内容物泄漏。少量细胞SSC和FSC信号增强，细胞膜破裂，可能发生膜黏连现象。因此，PDI处理致使细胞死亡的原因可能是ROS作用于细胞膜，致使细胞膜严重受损或者物质运输受阻，最终细胞因为不能进行正常生命活动而死亡。图5a所示，Cs、CCs/dark、和CCs/light组OD260 nm与空白组相比分别上升了14.18%、19.15%和25.33%。可能是因为S. aureus细胞膜被壳聚糖、姜黄素和ROS破坏，核酸物质从细胞内泄漏到培养基中。因此，壳聚糖、姜黄素和ROS皆可引起S. aureus细胞膜通透性增加。而且CCs/light组中产有外源性ROS，对细胞膜通透性影响最显著（P＜0.01）。S. aureus死亡和细胞膜通透性增加直接相关。进一步通过蛋白质泄漏实验评估PDI处理对细胞膜通透性的影响。如图5b所示，CCs/light组上清液中蛋白质量浓度极显著提高（P＜0.01），说明ROS与壳聚糖和姜黄素相比有更强的破坏作用。蛋白质泄漏情况与核酸泄漏情况相似，进一步说明PDI处理能够增加细菌细胞膜通透性。如图5c所示，与空白相比，经CCs/light处理的细菌MDA浓度极显著增加（P＜0.01）。MDA是细菌脂质膜过氧化的最典型产物之一。MDA浓度升高是细胞膜上磷脂分子氧化所导致的，磷脂分子的过度氧化会改变细胞膜通透性，这说明ROS通过氧化细胞膜磷脂分子进而影响细胞膜通透性。3.2 光动力涂膜对S.aureus微观形态的影响尽管通过流式细胞仪测定已经证明PDI处理会导致部分细胞形态变化，但具体结果尚不清晰。为进一步明确结构微观变化，研究采用SEM揭示PDI处理后S. aureus细胞微观结构层面的变化。如图6a所示，KB组S. aureus表现出正常的细胞形态，呈球形或椭圆形，大小均一、形态完整、表面光滑。在Cs组中，经壳聚糖涂膜溶液处理后细菌表面附着大量壳聚糖颗粒（图6b），表明壳聚糖可以吸附于细菌细胞壁表面。此外，细胞表面粗糙、出现褶皱和裂痕，少量细胞表面出现孔洞，但大部分细胞仍维持原有形态。这是由于壳聚糖与S. aureus表面蛋白质、磷脂等发生静电吸引作用，改变了细胞壁结构。经CCs/dark处理的S. aureus表面也吸附了大量颗粒（图6d），而与Cs、Curs/light处理相比（图6b、c），CCs组表面颗粒大小明显高于两组，说明壳聚糖的存在增加了姜黄素在细胞表面的吸附量。为了进一步验证该结果，采用紫外-可见全光谱扫描测定了壳聚糖对姜黄素的吸附效果，结果如图6f所示。由姜黄素的最大吸光度可知，姜黄素在蒸馏水和乙酸溶液中溶解度较差，而在Cs中溶解度明显高于二者，这是由于壳聚糖分子载体作用。为了揭示二者的相互作用，测定二者的傅里叶变换红外光谱。结果表明，壳聚糖和姜黄素之间未产生新的化学键，但是羟基（3 283.96 cm－1）的强度和波数发生了变化（图6g），这是由非共价相互作用和氢键共同作用的结果。上述结果表明，壳聚糖发挥了纽带作用，增强姜黄素和细菌的结合能力。结合之后的CCs，经PDI处理后，S. aureus细胞呈现严重损伤，细胞膜遭到破坏，细胞内容物大面积泄漏，失去细胞正常形态，形成很多碎片和空壳（图6e）。与Curs/light结果对比说明，壳聚糖增强了姜黄素对细菌的PDI效果，同时也说明对细胞产生不可逆损伤，最终造成细胞破裂是壳聚糖、姜黄素和ROS共同作用于细胞膜和细胞壁的结果，其中ROS影响最大。图6结果在验证上述核酸、蛋白质和MDA测定结果的同时，说明壳聚糖在连接姜黄素和细菌过程中发挥重要作用，同时也论证了PDI处理破坏细菌细胞结构完整性的结论。细胞膜作为细胞屏障，其完整性是细胞生长、繁殖和其他生理活动的基础，细胞膜破损程度，直接影响细胞生命活性。PDI处理通过作用于细胞膜，破坏细胞膜和细胞壁结构，促使细胞内核酸、蛋白质、多糖等营养物质泄漏。随着破坏程度增强，细胞内营养物质含量降低，将无法维持细胞正常生命活动。3.3 光动力涂膜对S.aureus细胞内源性酶活性的影响AKP在微生物体内可直接参与磷酸基团的转移和代谢，存在于细胞壁和细胞膜之间。细胞壁受损时，AKP由胞内渗出，细菌磷酸基团代谢途径受到影响。如图7a所示，经Cs处理后，S. aureus AKP活性极显著高于KB组（P＜0.01）。这是因为壳聚糖分子增加了S. aureus细胞壁通透性，使AKP从细胞膜中泄漏出来。而CCs/light处理后S. aureus较Cs组AKP活性下降。这是因为ROS非靶向攻击蛋白质的一级结构，影响二级结构形成，破坏AKP完整性，促使AKP活性位点消失，进而使S. aureus AKP活性下降。AKP活性改变，说明ROS能破坏细胞壁结构，同时攻击细胞内源酶，破坏细胞正常代谢途径。![]()
如图7b所示，Cs、CCs/dark、与KB组相比ATP酶活性下降，CCs/light组极显著低于KB组（P＜0.01）。这是因为壳聚糖和姜黄素破坏细胞壁结构，诱导质子动力势（PMF）崩溃。PMF是由Δψ和ΔpH组成的电化学梯度，PMF驱动膜运输系统促进ATP合成和离子及其他代谢物的积累。细胞膜内外PMF崩溃导致ATP酶合成相应减少。而CCs/light组ATP酶活性最低，壳聚糖的存在使ROS更容易进入细胞内并作用于ATP酶，导致ATP酶活性进一步下降。ATP酶失活使细胞无法通过分解ATP实现能量转移以维持生命活动，最终导致S. aureus死亡。图7c、d分别是不同处理条件下S. aureus细胞内SOD、POD活性。CCs/light处理组与KB组相比S. aureus细胞内SOD和POD活性极显著增加（P＜0.01）。这是因为PDI处理产生的ROS进入细胞内部，细菌防御机制启动，以SOD、POD为代表的抗氧化酶大量表达以维持内部ROS平衡并保护细胞免受损伤。SOD将ROS催化为H2O2，随着H2O2含量升高，细胞快速转录翻译，产生POD将H2O2降解为H2O。因此，SOD和POD活性升高是细菌为了应对高ROS环境做出的反应。总之，PDI处理产生的ROS会引发细菌防御机制启动，SOD、POD活性升高。随着细胞壁被破坏，大量ROS进入细胞内部。最后，因为ROS和H2O2含量过高，细胞内SOD、POD和其他抗氧化酶不能将其恢复到正常水平，进而影响AKP和ATP酶活性。结果导致S. aureus生物合成、磷酸转移、能量运输途径受阻，从而抑制S.aureus的生长。3.4 光动力涂膜对S.aureus细胞内DNA和蛋白质的影响
通过琼脂糖凝胶电泳测定光动力涂膜对S.aureus基因组DNA的影响。如图8a所示，空白对照组DNA电泳条带亮度高，图像清晰；而CCs/light组的基因组DNA条带亮度降低，清晰度降低。ROS氧化作用是导致细胞DNA损伤的主要因素之一。外源性ROS渗透和内部抗氧化防御系统崩溃导致细胞内ROS含量急剧上升，进而损伤DNA。另外，外源性ROS可直接与核酸物质反应，DNA发生氧化损伤，如单链或双链切割、交联和碱基序列变化。DNA损伤导致转录过程中断或破坏，进而导致细胞死亡。同时，ROS、壳聚糖和姜黄素可作用于参与DNA修复的酶（如DNA聚合酶），导致酶失活或功能改变，造成DNA损伤无法修复。细胞中产生的脂质过氧化产物，如MDA，也可以导致DNA和蛋白质交联，引起DNA损伤。通过SDS-PAGE测定光动力涂膜对S.aureus蛋白质的影响。观察电泳图像发现，与KB组相比，Cs和CCs/dark组在70 kDa左右的条带亮度下降，80 kDa左右的条带亮度提高（图8b），可能和细菌的应激反应相关。而CCs/light组的蛋白质条带严重降解，说明ROS在细胞内部非定向氧化，使得细胞内蛋白质分子氧化变性，丧失原本的结构。部分胞内酶由蛋白质构成，蛋白质结构损伤也是影响酶活性的重要原因。另外，基因组DNA损伤影响RNA转录翻译，细菌蛋白质合成能力下降是蛋白质条带降解的重要原因。
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综上所述，ROS通过破坏细胞膜致使细胞内ROS含量急速增加，最后因细胞内ROS含量过高导致细胞防御系统崩溃，损伤细菌基因组DNA和蛋白质等生物大分子。因此，PDI清除S. aureus是多靶点致死效应导致的结果，而ROS破坏细菌体内DNA和蛋白质导致细菌产生不可逆损伤，是造成S. aureus死亡的重要因素。为促进姜黄素与细菌的结合，改善PDI处理时姜黄素利用率低的问题，本研究利用壳聚糖的细菌黏附性特点制备了壳聚糖/姜黄素光动力涂膜以增强PDI抑菌效果。在此基础上，探究了影响涂膜抑菌效率的关键因素及PDI抑菌机理。结果显示，PDI处理对S. aureus有优异的抑制作用，姜黄素质量浓度为25 mg/L的壳聚糖涂膜溶液在波长为420 nm蓝光处光照仅5 min，对S. aureus可达到99.9%以上的灭活效果。壳聚糖的加入增强了姜黄素和细菌的结合，有利于PDI处理产生的ROS直接作用于细胞膜，破坏细菌第一层屏障，进入细胞内，致使细菌细胞形态改变，蛋白质和DNA泄漏。同时，ROS作用于AKP、ATP酶、POD和SOD等内源酶，进而破坏细胞内生物合成、能量转化和细胞防御系统，并且影响细胞内DNA和蛋白质等生物大分子，影响RNA转录、DNA自我修复、酶的合成和细胞膜修复，最终导致S. aureus死亡。综上，PDI是一种损伤逐渐积累的多靶点杀菌技术。本研究结果可为PDI在食品安全领域中的应用提供理论基础。本文《壳聚糖/姜黄素光动力复合涂膜对金黄色葡萄球菌的抑菌效果及机理》来源于《食品科学》2024年45卷第6期233-243页，作者：张鹏敏, 王文秀, 孙剑锋, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230429-284。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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