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核桃粕是核桃榨油后的副产物，蛋白含量可达43.8%，且氨基酸种类丰富，是一种可为人体提供丰富氨基酸的植物源蛋白原料。但目前核桃粕整体利用率较低，常被用于动物饲料或直接丢弃，导致蛋白资源的浪费。核桃粕蛋白主要由谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶谷蛋白构成。为充分利用核桃粕，提高其资源利用率，以核桃粕谷蛋白为原料，采用菌酶协同固态发酵的方式制备抗菌肽。
新疆农业大学食品科学与药学学院的马慧、顾雪敏、孔令明*等在前期实验的基础上，为获得具有更高活性的核桃粕谷蛋白抗菌肽段，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为指标，采用超滤、凝胶过滤层析分离、液相色谱-串联质谱进一步分离纯化谷蛋白抗菌肽，筛选出具有较强活性的多肽。并通过分子对接技术对谷蛋白抗菌肽与大肠杆菌进行对接模拟，对其生物学性质进行评价并确定其分子机制。后通过研究谷蛋白抗菌肽在高温热处理、紫外线、不同pH值和不同蛋白酶处理后的抑菌性保持率表征其稳定性，这一研究不但能够提高核桃粕的综合利用价值，而且对核桃谷蛋白抗菌肽的开发利用具有意义，同时为研发一种新型抗生素的替代品及食品级抗菌剂提供新的思路。
如图1所示，核桃谷蛋白抗菌肽超滤后分离出4 种不同分子质量的多肽组分：WGP-I（Mw＜3 kDa）、 WGP-II（3 kDa＜Mw＜10 kDa）、WGP-III（10 kDa＜Mw＜30 kDa）、WGP-IV（Mw＞30 kDa）。这4 种组分对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。WGP-III组分的抑菌圈直径显著大于其他3 种组分，对大肠杆菌的抑菌圈直径为19.53 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为18.51 mm，抑菌活性最强；WGP-II有较强的抑菌活性；WGP-I和WGP-IV抑菌活性相对较弱，但抑菌圈平均直径也大于13 mm。![]()
进一步对WGP-III组分进行凝胶过滤层析分离。由图2可知，共得到3 个组分。经过抑菌性测定，组分A和C对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较优（表1），对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均达到15 mm以上，且与B组分对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径有显著差异。因此，本研究选择 WGP-IIIA、WGP-IIIC组分做进一步抗菌肽鉴定。用LC-MS/MS对WGP-IIIA和WGP-IIIC组分中抗菌肽进行鉴定，得到的肽段通过APD筛选有可能成为抗菌肽的肽序列，将筛选得到的序列通过NovoPro在线工具预测，选择疏水性和净电荷数均较高的肽段。
如表2所示，从WGP-IIIA 组分中得到1 条疏水性和净电荷均较高的肽段，为Leu-Ala-Glu-Ala-Tyr-Asn-Ile-Pro-Asp-Thr-Ile-Ala-Arg-Arg-Leu（LAEAYNIPDTIARRL）；从WGP-IIIC组分中得到5条疏水性和净电荷数均较高的抗菌肽，分别为Ala-Pro-Gln-Leu-Val-Tyr-Ile-Ala-Arg（APQLVYIAR）、Ser-His-Ser-Val-Ile-Tyr-Val-Ile-Arg（SHSVIYVIR）、Ala-Pro-Gln-Leu-Leu-Tyr-Ile-Val-Lys（APQLLYIVK）、Asp-Val-Leu-Ile-Asn-Ala-Tyr-Arg（DVLINAYR）、Ser-Val-Ile-Tyr-Val-Ile-Arg-Gly-Asn（SVIYVIRGN），这5条肽段肽链长度均为8～9个氨基酸，且以九肽为主，分子质量为962.5185～1 072.6029Da，肽段鉴定得分都在100分以上。6条多肽质谱图如图3所示。抗菌肽抑菌活性强弱与多肽序列中某些特殊氨基酸残基密切相关，如富含Arg和Val的抗菌肽由于和细胞膜脂质层有较强的静电吸附力而发挥良好抗菌活性；富含Pro和Gly对稳定结构与抗菌活性发挥有重要作用。而鉴定得到的6 条抗菌肽中WGP-IIIC组分中的APQLVYIAR含有Val和Arg；SHSVIYVIR富含Val和Arg；APQLLYIVK中含有Pro和Val；DVLINAYR中含有Val和Arg；SVIYVIRGN中含有Val、Arg、Gly。WGP-IIIA组分中的LAEAYNIPDTIARRL含有Ala、Pro和Arg。说明鉴定得到的6 条多肽序列具有较强的抑菌活性。
分子对接是预测配体结合模式及其与靶蛋白受体结合能的首选方法。对接分子间能是配体与受体结合时活性口袋复合物分子本身所具有的内张力，它决定着分子结合的稳定程度，内能越小，结合越稳定。而分子对接中结合能越低，多肽与配体的结合作用力越强。因此，以结合能和分子间能为指标，将6条抗菌肽与大肠杆菌来源结晶体6SPP进行分子对接模拟。
分子对接结果表明，多肽与6SPP之间至少有1 种相互作用，这些相互作用（氢键作用、疏水相互作用、范德华力）可以稳定多肽-受体结构。如表3所示，在筛选得出的6 条多肽中，WGP-IIIC组分的SHSVIYVIR和APQLLYIVK结合能和分子间能都较低，结合能分别为0.78、1.64 kcal/mol，分子间能分别为－9.07、－9.10 kcal/mol。WGP-IIIA组分的LAEAYNIPDTIARRL 结合能为9.20 kcal/mol，分子间能为－4.52 kcal/mol。即WGP-IIIC组分的SHSVIYVIR和APQLLYIVK与大肠杆菌表现出较强的结合能力。而WGP-IIIA组分的 LAEAYNIPDTIARRL与大肠杆菌分子间结合能力较差。图4所示为6SPP活性结合区域，结合图5～7可知， SHSVIYVIR与Asn507（2.42 Å）和Asn525（2.37 Å）形成了2 个常规氢键，与Glu509、Glu500、Glu503、Thr508、Ala504形成了范德华力。APQLLYIVK与Asp156（2.31 Å）、Asp138（2.21 Å）、Gln227（2.10 Å）、Thr168（3.00 Å）、Ser125（2.98 Å）形成了5 个常规氢键，与Phe191（4.98 Å）和Ile124（5.08 Å）形成疏水相互作用，与Trp229、Pro167、Gln228、Gln126、Ser166、 Met184和Glu169形成了范德华力。LAEAYNIPDTIARRL与Gly398（2.37 Å）和Ser394（2.22 Å）形成2 个氢键，与Lys465、Pro460、Arg395、Phe399形成范德华力。综合分析，LAEAYNIPDTIARRL与大肠杆菌分子间的作用力较SHSVIYVIR和APQLLYIVK少，所形成的多肽-受体结构相对不稳定。结合抑菌实验结果，WGP-IIIC组分的抑菌活性比WGP-IIIA组分强。![]()
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由图8A可知，谷蛋白抗菌肽在－20 ℃条件下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性保持率分别为85.16%和87.45%，随温度升高，抑菌活性也相对下降。当温度到达90 ℃时，抗菌肽对大肠杆菌的抑菌性保持率下降至56.8%，对金黄色葡萄球菌抑菌性保持率下降至33.98%。当抗菌肽在121 ℃下处理30 min后，对大肠杆菌的抑菌性保持率为31.62%，对金黄色葡萄球菌抑菌性保持率为 16.11%，表明在高温处理下，核桃谷蛋白抗菌肽对大肠杆菌仍具有一定的抑菌效果，对金黄色葡萄球菌抑菌性保持率较差。由图8B可知，在90 ℃沸水中，随加热时间延长，抗菌肽对2种菌的抑菌活性呈现下降趋势，加热到25 min时，谷蛋白抗菌肽对大肠杆菌的抑菌性保持率为47.49%，对金黄色葡萄球菌抑菌性保持率仅为24.79%。结合加热温度的影响结果，核桃谷蛋白抗菌肽具有一定的耐热性，这与张琦等研究结果一致。但过度的高温也会造成抗菌肽抑菌活性下降，原因可能是高温破坏了抗菌肽的结构，使其活力消失。因此，为消除因受热导致的抗菌活性降低问题，抗菌肽应注意低温保存。
如图9所示，紫外照射时间对谷蛋白抗菌肽的抑菌活性影响较小。在10～50 min，抑菌性保持率缓慢下降直至趋于平缓。对大肠杆菌平均抑菌性保持率为88.9%，对金黄色葡萄球菌平均抑菌性保持率为84.78%，说明谷蛋白抗菌肽在50 min内对紫外线具有较高的稳定性，这可能是由于抗菌肽经紫外线照射后结构与性质并未发生改变，因此对抑菌活性的影响也较小。由图10可知，随pH值升高，抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性保持率呈现先增加再降低的趋势。pH 2～10平均抑菌性保持率大于30%，其中，pH值为2和10时抑菌活力较低，pH 6～8时抑菌性保持率较高，pH 8时，谷蛋白抗菌肽对大肠杆菌抑菌性保持率达到87.58%，对金黄色葡萄球菌的抑菌性保持率达到85.33%。综上，谷蛋白抗菌肽具有一定的耐酸碱能力。![]()
由图11可知，谷蛋白抗菌肽对中性蛋白酶最耐受，受酸性蛋白酶影响最大。在酸性蛋白酶作用下，抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌性保持率仅为24.17% 和19.01%。除中性蛋白酶、复合蛋白酶和胃蛋白酶外，抗菌肽在其他酶作用下对2 种致病菌的抑菌性保持率均在35%以下。表明谷蛋白抗菌肽易受蛋白酶影响，实际应用中应注意酶解对抗菌肽的影响。![]()
通过菌酶协同固态发酵法（枯草芽孢杆菌和碱性蛋白酶协同）制备核桃粕谷蛋白抗菌肽，经超滤、凝胶层析过滤分离、LC-MS/MS鉴定后，筛选高活性肽段，结合分子对接手段分析高活性肽段对大肠杆菌原始株来源的晶体结构（PDB ID：6SPP）相互作用的氨基酸残基及作用力模式。进一步对制备的谷蛋白抗菌肽进行热稳定性、酸碱稳定性、紫外照射稳定性及不同蛋白酶处理下的稳定性分析，为谷蛋白抑菌肽的应用提供理论依据。
具体结果如下：WGP超滤分离结果表明分子质量3～10 kDa的组分WGP-III抑菌效果最好；WGP-III组分经过SephadexG-25层析纯化后，共分离出3 个组分，选择抑菌效果较好的WGP-IIIA和WGP-IIIC进行LC-MS/MS鉴定；LC-MS/MS鉴定结合分子对接筛选得到3 个多肽序列，包括WGP-IIIA组分的LAEAYNIPDTIARRL和WGPIIIC组分的SHSVIYVIR、APQLLYIVK，以上3 个多肽与6SPP之间至少有1 种相互作用（氢键作用、疏水相互作用、范德华力），这些作用力可能是谷蛋白抗菌肽对大肠杆菌具有良好抑制作用的原因，分子对接结合抑菌结果显示，WGP-IIIC组分的抑菌活性比WGP-IIIA组分强；谷蛋白抗菌肽具有良好的稳定性，经不同加热时间、不同温度、紫外线照射和不同蛋白酶处理后依旧具有较好的抑菌性保持率，具有一定的耐高温、耐低温能力，－20 ℃贮藏条件下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌性保持率分别为85.16%和87.45%，90℃时，抗菌肽对大肠杆菌的抑菌活性最好，121 ℃下对大肠杆菌的抑菌性保持率为31.62%。这一特性可应用于冷热加工食品的防腐保鲜剂领域。未来的研究方向应聚焦于谷蛋白抗菌肽的生物抑菌特性以及在体内的安全性机制分析，为抗菌肽作为新型抗生素的替代品以及在食品级抗菌剂领域的具体应用提供新思路。
本文《核桃谷蛋白抗菌肽的分离纯化及抑菌稳定性分析》来源于《食品科学》2024年45卷第07期69-77，作者：马慧，顾雪敏，梅洁，李芳，王佳利，王梓棚，孔令明*。DOI : 10.7506/spkx1002-6630-20230803 -015。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。实习编辑：林安琪；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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