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罗非鱼是我国重要的淡水养殖品种鱼之一。罗非鱼肌肉中的主要成分之一是肌原纤维蛋白（MP），MP含量占蛋白质总量的50%～70%。MP因同时具有亲水和亲油性，在乳化过程中能够自发吸附到油-水界面，降低界面张力并为乳液提供物理及化学稳定性，是良好的乳化剂和稳定剂。
乳液是由一种或多种物质分散在一种液体中所形成的分散体，通常由分散相和连续相组成，分散相为油相，连续相为水相。乳液的稳定性取决于吸附在油-水界面上的乳化剂，主要与吸附剂颗粒的物理化学性质和界面层的黏弹性行为有关。
海南大学食品科学与工程学院的何冬雪、冯紫蓝、裴志胜*等使用罗非鱼MP和玉米油制备乳液，以界面蛋白质作为研究对象，探究其结构变化与乳液界面层稳定性的关系。首先使用同源建模获得肌球蛋白模型，然后利用MD模拟乳液形成过程中表面肌球蛋白从初始到最终3D结构构象的变化。最后结合拉曼光谱分析MP二级结构及其侧链微环境变化，获得更准确的乳化过程油-水界面MP结构与乳液界面层稳定性的关系。
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建模获得的肌球蛋白乳液蛋白模型可以使用拉氏图和Verify 3D评价结果来评估其准确性和合理性。罗非鱼肌球蛋白氨基酸序列与建模获得的肌球蛋白乳液蛋白模型的氨基酸序列对比如图1A所示，对模型进行评估得到的拉氏图如图1B所示，有666个（89.0%）氨基酸残基处于红色区域，71个（9.5%）氨基酸残基处于黄色区域，9个（1.2%）氨基酸残基处于浅黄色区域，处于白色区域的氨基酸残基只有2个，占全部氨基酸残基的0.3%。通常认为允许区（包括红色核心最适区、黄色最大允许区和浅黄色一般允许区）内的氨基酸残基含量大于90%即可认为该氨基酸具有良好的构象。可见，该肌球蛋白的空间构象模型具有一定准确性且合理。有研究者对PSE鸡肉MP的肌球蛋白进行同源建模，模型中97.8%的氨基酸残基位于允许区，与本研究结果相近，说明本研究中同源建模结果具有准确性。此外，Verify 3D检验要求至少80%氨基酸残基的平均3D-1D分值不小于0.2，图1C显示，肌球蛋白模型中有88.59%氨基酸残基平均3D-1D值≥0.2，Verify 3D检验通过。综上所述，肌球蛋白建模的拉氏图和Verify 3D指标评价合理，因此，可以认为该肌球蛋白模型结构合理，可以进行分子对接。通过可视化得到肌球蛋白3D结构图像，由图2、3可知，α-螺旋构象贯穿整个蛋白质分子，起主干作用，是蛋白质结构的重要组成部分，有利于蛋白质保水性和凝胶性。β-折叠穿插于主干中间部分，其他结构则无规则、不定量随机分布在整个蛋白质分子内部及周围。不同油相体积分数乳液界面肌球蛋白在0～100 ns模拟期间不停运动，蛋白质大分子构象转变和空间结构变化发生了明显活动轨迹。蛋白质分子在不同构象之间转化较少，但是在空间位置上有比较明显的变化。肌球蛋白从初始构象到最终构象变化的位置大致相同，主要分布在蛋白质分子顶端、右端和连接尾部位置。主要变化位置观察到大部分是由β-折叠、β-转角转变为无规卷曲，显示出较少α-螺旋结构变化，说明界面蛋白质具有稳定的主链结构。有研究表明，无规卷曲结构数量增多对蛋白质吸附于油-水界面起到积极作用，说明MD模拟的肌球蛋白结构变化与乳液形成过程蛋白质结构倾向变化相符。值得注意的是，在不同油相体系中，蛋白质在连接尾部位置表现出明显的不同构象变化。在油相体积分数为68%的乳液体系中，会发生α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲之间的相互转变。从微观结构可以看出，蛋白吸附到油-水界面可以形成蛋白质膜将液滴包裹，此时乳液体系的液滴粒径较均匀（图2B）。MD模拟显示该蛋白质含有较多的色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）残基，乳液体系也相对稳定。在油相体积分数70%乳液体系中，蛋白结构中只有少量α-螺旋结构和无规卷曲结构发生转换。此时观察到乳液为破乳状态，这是由于蛋白质界面遭到破坏，油脂溢出形成大油滴、乳液结构被破坏。油-水界面完全被破坏，油滴大量聚集，乳液失去稳定性，可能由该部位氨基酸残基变化引起的蛋白质构象变化导致。由图4可知，油相体积分数为70%乳液中，界面蛋白氨基酸残基的均方根波动（RMSF）变化最大，且位于395～410位的氨基酸残基RMSF变化最大，说明蛋白质柔性不稳定。此外，乳化剂能够乳化的油脂有限，当油相体积分数较高时，可能会导致油滴增大，进一步导致界面膜解吸和塌陷，降低乳液稳定性，也会产生破乳现象。![]()
图5反映了0～100 ns时间内肌球蛋白二级结构随模拟时间的变化。分子模型预测的肌球蛋白在80～100 ns内的二级结构含量如表1所示。MD模型中80～100 ns期间，在不同油相体积分数乳液中罗非鱼肌球蛋白α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲相对含量存在一定差异，这可能会导致不同油相体积分数乳液体系中存在不同数量的化学键和作用力。
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MD模拟显示，每个体系在80～100 ns的轨迹变化中，α-螺旋结构在油相体积分数为68%时相对含量最低（P＜0.05），在70%时又有所回升；相反地，β-转角和无规卷曲结构在油相体积分数为68%时相对含量最高（P＜0.05）。β-折叠、β-转角的含量变化可能是由蛋白结构中的共价键和氢键变化导致。油相体积分数变化导致乳液体系中β-折叠/转角结构相对含量稍微上升或下降，但变化范围不大，氢键数量随模拟时间的变化（图6A）也印证了这一结果。β-折叠和β-转角结构相对含量变化说明在乳液体系中蛋白结构处于比较松散的状态。研究显示，适度松散的蛋白质结构可以促进疏水基团暴露，对蛋白质油脂乳化具有积极作用。同时，分子模型模拟轨迹预测结果显示，油相体积分数为68%时，肌球蛋白α-螺旋存在结构解离，使疏水性氨基酸残基暴露，疏水性增加，这与溶剂可及表面积（SASA）的结果一致（图6B）。在油-水界面，不同大小的蛋白质聚集体的形成会使表面疏水性、巯基、氢键含量等发生不同的变化，从而导致蛋白质结构发生变化。蛋白质结构变化导致其乳化性质变化，进一步影响乳液的形成和稳定。由图6B可知，在乳液体系中，SASA均显著高于纯蛋白质。当油相体积分数为68%时，蛋白质SASA达到最高，氢键数量没有明显下降。说明在适当的水相和油相环境中，埋藏的疏水性残基暴露在极性溶剂表面，使蛋白质结构发生正向变化，这对肌球蛋白乳液体系的稳定性具有促进作用。2.1 乳液体系中蛋白质主链特征结构的拉曼光谱分析
拉曼光谱不仅可以提供蛋白质主链二级结构的信息，还可以探索有关蛋白质侧链微环境和化学变化的相关信息。由图7可知，不同乳液体系中，界面MP在1 600～1 700 cm-1区域具有很强烈的酰胺I带吸收峰，这一区域的谱带能够提供丰富的关于蛋白质二级结构的信息。其中1 600～1 640 cm-1表示β-折叠，1 640～1 650 cm-1表示无规卷曲、1 650～1 660 cm-1表示α-螺旋，1 660～1 700 cm-1表示β-转角。通过拉曼光谱酰胺I带高斯曲线拟合以及定量计算特征峰的峰面积得到蛋白质二级结构分布结果如图7B所示。蛋白质高斯拟合图（图7C～E）显示，蛋白质二级结构中α-螺旋结构占据较大比例。图7B显示了相同的结果，这与MD模拟结果（表1和图2）一致。不同的是，油相体积分数为68%时，乳液界面MP结构中α-螺旋结构的比例最大，可能是由于MP中还存在少量的肌动蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白。此外，β-折叠和β-转角在MP的二级结构中也占据了较大比例，大约为40%，略高于MD模拟结果。导致该现象发生最有可能的原因有2 个：一是计算机和仪器存在不可避免的系统误差；二是油-水界面上蛋白质结构不完全同一，不同部位的界面蛋白可能存在不同的蛋白质结构。由图7B可知，在油相体积分数为68%和70%的乳液体系中，α-螺旋构象相对含量有所上升，同时也导致β-折叠和β-转角结构相对含量下降。这一结果表明，乳液体系中油相体积分数增大，促进了蛋白质解折叠，形成螺旋结构。这一结果与分子模型预测的SASA（图6B）结果相对应。通常情况下，β-折叠和α-螺旋通过蛋白质分子肽链之间的氢键维持稳定，蛋白质聚集改善了疏水环境，促进MP解折叠。但在高油相体积分数的MP乳液体系中，蛋白质发生解折叠的数量差异不大，说明高油相体积分数乳液体系中不同的疏水环境对MP发生解折叠没有起到显著作用。2.2 乳液体系中蛋白质侧链特征结构的拉曼光谱分析
Trp残基是其他氨基酸残基中最大的侧链，分析其在蛋白质拉曼光谱中的强带对蛋白质二级结构解析具有重要意义。Trp残基的微环境变化可在拉曼光谱中760、1 340 cm-1处的特征峰观察到。由图8A可知，在油相体积分数为68%时，760、1 340 cm-1处具有较高的特征峰强度，说明Trp残基环的伸缩振动，离开极性水溶液，被暴露在疏水环境中。Trp残基从极性环境中的包埋状态向疏水环境中的暴露状态转变，疏水性增大。在黄油、猪油和大豆油与MP制备的乳液中观察到形成了具有更稳定乳化层的大豆油乳液。此外，这一结果与分子模型在80～100 ns模拟过程中的SASA（图6B）变化相对应。Trp和Tyr残基特征峰强度变化均体现了乳液体系中蛋白质侧链的微环境变化。蛋白分子表面的Tyr残基通常呈暴露状态或包埋状态，处于暴露状态时可以与H2O结合，这与疏水微环境有关。拉曼光谱850、830 cm-1附近的特征峰强度变化体现了Tyr的费米共振，其变化是由于蛋白质侧链微环境发生改变。当I850/I830≥1时，表示Tyr残基在疏水环境中处于暴露状态；当I850/I830＜1时，表示Tyr残基在疏水环境中处于包埋状态。图8A结果显示，所有乳液体系中，I850/I830均大于1，说明MP的Tyr残基在疏水环境中为暴露状态。此时Tyr残基可作为氢键的供体或受体与水结合，从而改善疏水环境。油相体积分数70%的乳液体系中，Tyr残基同样暴露于疏水环境中，但体系不稳定。疏水性氨基酸残基的变化反映了先前MD模拟分析的结果，存在氢键的断裂和生成，表明蛋白质内部暴露的疏水基团促进了蛋白质结构展开。但疏水性和亲水性之间的相互作用可能会导致I850/I830的显著变化，因此还需要通过其他形式辅助才能更准确地分析蛋白质分子表面Tyr残基变化情况。500～550 cm-1的拉曼光谱归属于二硫键（S—S）。在此范围内的构象有：500～510 cm-1处为gauche gauche-gauche（g-g-g）构象的S—S 拉伸带，515～525 cm-1处为gauche-gauche-trans（g-g-t）构象的S—S拉伸带，535～545 cm-1处为trans-gauche-trans（t-g-t）构象的S—S拉伸带。g-g-g构象的谱带表明MP中的一些二硫键处于较低势能构象，t-g-t构象的谱带是由于存在胱氨酸残基构象转变或者Trp脂肪族侧链的C—H弯曲振动。由图8B可知，在拉曼光谱中，无法观察到明显属于S—S的特征谱带，这可能是由于水分子存在，放宽谱带掩盖了S—S和C—H键产生的谱带。为更准确研究不同油脂体积分数乳液体系中蛋白质的结构变化，使用MD模拟结合拉曼光谱对乳液体系表面MP的构象变化进行分析。结果显示：α-螺旋结构（相对含量48%左右）是蛋白质二级结构的重要组成部分，β-转角、β-折叠和无规卷曲相对含量均为10%～26%；肌球蛋白3D空间结构显示，最终蛋白构象与初始构象相比，主要体现在空间位置发生变化；此外，不同油脂体积分数体系的蛋白质在相似位置也发生了不同构象变化，差距较大的是界面蛋白在连接尾部位置观察到更多二级结构和空间构象变化，当油相体积分数增大，β-转角和β-折叠数量下降，促进了乳液体系中蛋白质解折叠并向α-螺旋转变。疏水性氨基酸残基的变化说明蛋白质存在离子键和氢键的合成与断裂，进一步说明蛋白质结构的展开情况以及内部疏水基团的暴露情况。较稳定的乳液体系中，肌球蛋白SASA较大，Trp和Tyr残基暴露程度也大于其他体系，说明MP的Tyr残基暴露于疏水环境，Trp残基从包埋状态转变成暴露状态，疏水相互作用增强，氢键数量增多。但是拉曼光谱中S—S特征峰没有明显谱带，可能是由于蛋白质中含有微量的胱氨酸残基和C—H弯曲振动及水分子的存在。总的来说，MP乳液体系油-水界面蛋白质主要通过改变结构构象和SASA促进Trp和Tyr附近微环境变化，改善内部分子之间的氢键和疏水相互作用，从而提高乳液的稳定性。该研究阐明了MP在乳液界面的结构变化，为使用罗非鱼MP制备稳定乳液及其应用提供了有价值的信息。本文《分子动力学结合拉曼光谱评价乳液界面蛋白结构变化》来源于《食品科学》2024年45卷7期97-95页. 作者：何冬雪，冯紫蓝，申铉日，裴志胜. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230813-087. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
