1 重组蛋白的表达
1.1 AK片段表达载体的构建及测序
根据拟穴青蟹AK的AA序列（GI：375298903）和已解析的晶体结构（PDB：5ZHQ），以及已鉴定的抗原表位，AK的N端α-螺旋结构域中包含1 个位于AA 29～53的线性表位区域，因此首先确定AK-E1为AA 1～92。在AK分子C端的α-β结构域中，主要有3 个线性表位的分布区域：AA 101～110和AA 113～155、AA 204～225、AA 308～330。根据线性表位在C端结构域的分布，并确保各分段表达产物相对分子质量较一致且分段表达产物中α-螺旋和β-折叠结构不受破坏，从无规卷曲区域选择AK的分段位点，确定AK的C端的α-β结构域分为AK-E2（AA 87～187）、AK-E3（AA 172～265）和AK-E4（AA 276～357）3 段（图1）。以rAK表达质粒pET-AK为PCR扩增模板，分别采用4 对引物进行扩增后，由琼脂糖凝胶电泳结果（图2）可知，扩增的4 个基因大小与设计的目的基因片段大小基本相符。将产物回收，构建分段克隆载体，转入Top 10克隆宿主大量扩增后，回收质粒，将目的条带与pET-28a载体双酶切后连接，构建分段表达载体，转化BL21表达宿主。选取菌落PCR阳性克隆子进行测序。
1.2 重组蛋白的诱导表达及nAK、rAK、分段表达产物的纯化
将测序结果正确的宿主表达菌在37 ℃下诱导表达后，提取超声处理的上清液和沉淀，用SDS-PAGE分析各重组蛋白的表达情况，并采用Western blot对表达产物进行鉴定。由图3可知，AK-E1为可溶表达，AK-E2、AK-E3和AK-E4则以包涵体形式表达，各分段表达产物大小约为14 kDa，与理论值相符，并且目的蛋白均能被兔抗拟穴青蟹AK IgG多克隆抗体特异性识别，表明获得的表达产物为AK的片段。AK-E1为可溶表达蛋白，直接上样于Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱，用Ni2+吸附纯化带有His标签的重组蛋白；AK-E2、AK-E3包涵体蛋白溶解于4 mol/L脲，透析复性后上样于Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱，用Ni2+吸附纯化带有His标签的重组蛋白；AK-E4包涵体蛋白溶解于4 mol/L脲，透析复性后离心收集上清液中的重组蛋白。分别参照Mao Haiyan、Yang Yang等的方法纯化rAK和nAK。通过SDS-PAGE检测经柱层析分离的样品（图4）并分别对各泳道的目的蛋白纯度进行分析，结果表明，纯化后目的蛋白纯度均达到90%以上。
2 重组蛋白的致敏性分析
2.1 重组蛋白和nAK致敏BALB/c小鼠的血清学分析
2.2 小鼠脾脏细胞培养上清液中细胞因子水平
2.3 rAK及AK分段表达产物对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响
讨论
水产品是人们日常饮食的重要组成部分，是营养的重要来源，但同时也是引起食物过敏的重要因素，甲壳类水产品引起的过敏反应可引起皮肤红疹、面部及喉部水肿，甚至引发休克，在亚洲沿海地区这种现象尤为常见，因此，甲壳类水产品过敏原的研究开始受到广泛关注。重组过敏原可以作为天然过敏原的一种替代物，特别是用于过敏原标准物的制备，在过敏原研究中具有重要意义。
重组表达系统主要包括原核表达系统、真核表达系统和无细胞表达系统，其中大肠杆菌原核表达系统因其成本低、表达量高、易于培养等优势被广泛应用于重组过敏原的表达。史云凤等以大肠杆菌原核表达系统成功重组表达了花生过敏原Ara h 1，并通过体内和体外致敏性评估方法证实重组Ara h 1与天然Ara h 1蛋白性质、致敏性相似。此外，目前已有多种由大肠杆菌表达系统获得的重组过敏原被证实与天然过敏原具有相似的IgE结合性，并广泛应用于过敏原组分诊断和抗原特异性治疗等领域。但是大肠杆菌作为一种原核表达宿主，也存在缺乏翻译后修饰作用、无法使蛋白质形成正确折叠的空间结构等问题，而大多数过敏原属于糖蛋白，且多肽链经过正确折叠形成的空间结构对某些过敏原的致敏性也有重要影响，因此糖基化、二硫键形成等翻译后修饰过程是影响某些过敏原致敏性的关键因素。Huang Yuhao等以大肠杆菌表达宿主表达大菱鲆小清蛋白，对天然和重组小清蛋白等性质分析发现，重组小清蛋白钙离子结合方式与天然蛋白有所差异，导致其IgG结合活性及消化稳定性弱于天然过敏原。前期Mao Haiyan等证实rAK与nAK具有相似的IgE结合活性，但本研究通过体内实验证实二者的免疫原性存在较大差异，rAK致敏BALB/c小鼠后，血清中特异性抗体水平显著升高，但显著低于nAK致敏组小鼠；Th2型细胞因子（IL-4、IL-13）水平也显著低于nAK致敏组小鼠。RBL-2H3细胞的β-己糖苷酶释放率检测结果表明，rAK刺激效应细胞脱颗粒的能力较nAK弱，进一步证实尽管rAK的IgE结合活性与nAK相似，但在机体内，其免疫原性弱于天然过敏原。费丹霞对rAK和nAK的理化特性分析比较发现，rAK分子中二硫键含量较nAK少，且其热稳定性较天然蛋白差，在30 ℃时即产生多聚体。AK分子中的二硫键是其空间结构稳定性的关键，由此可推测，通过原核表达系统获得的rAK由于无法形成二硫键而导致空间结构变化及理化特性改变，是其免疫原性弱于nAK的重要原因。因此，由原核表达系统表达的rAK无法完全替代天然过敏原，通过更换表达系统，实现rAK分子的翻译后修饰和空间结构的正确形成是获得高免疫原性rAK的重要措施。尽管如此，低免疫原性的重组蛋白被证实在应用于过敏性疾病的临床诊断和过敏原特异性治疗过程中有较高的安全性，因此，rAK这种高IgE结合活性、低免疫原性的特点可为甲壳类水产品过敏性疾病的诊断和治疗提供参考。
过敏原分子中抗原表位是抗体分子和免疫细胞识别抗原的基本单位，因此，对于食物过敏的研究逐渐深入至抗原表位水平，关于甲壳类水产品AK抗原表位的研究也已较为深入。为进一步探究AK致敏的关键表位，本研究根据AK线性表位的分布情况及其结构域将AK分为AK-E1（AA 1～92）、AK-E2（AA 87～187）、AK-E3（AA 172～265）和AK-E4（AA 276～357）4 个部分，进行分段重组表达。以4 个分段表达产物免疫BALB/c小鼠，结果发现，AK-E2区域在机体内的免疫原性最强，而AK-E4最弱；利用RBL-2H3细胞模型对4 个分段表达产物刺激效应细胞的能力进行比较发现，AK-E2和AK-E4能刺激细胞释放较高水平的β-己糖苷酶。从AK分子的抗原表位分布情况看，AK-E1、AK-E3主要为构象表位分布区域，分段表达产物失去AK分子的空间结构，无法形成原有的构象表位，是该片段免疫原性较弱的重要原因；而AK-E2是AK分子中线性表位较为集中的区域，刺激机体产生免疫反应的能力较强，因此，针对该区域通过食品加工或分子生物学手段改造AK有望有效降低AK的致敏性。AK-E4也是AK分子中线性表位分布较多的区域，但其刺激机体产生AK特异性抗体的能力较弱，这可能与该片段长度较小有关，尽管如此，该片段对效应细胞具有较强的刺激作用，可能在机体过敏的效应阶段发挥较重要的作用，有望用于食品中过敏原的检测及蟹类过敏性疾病的诊断。
结论
实习编辑：王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。
图片来源于文章原文及摄图网。
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