樟芝（Antrodia cinnamomea），又名牛樟芝或牛樟菇，是一种珍稀药食两用真菌。目前，樟芝的人工培养方式主要有椴木栽培、平皿培养、固态发酵和液态发酵（又称深层发酵）。采用樟芝深层发酵所产生的无性孢子（即节孢子）接种取代传统菌丝接种的樟芝深层发酵工艺，已成为目前最高效、最受欢迎的樟芝人工培养方式。但是，该发酵工艺仍然存在不足，尤其是作为接种物的樟芝无性孢子产量较低，进而导致种子制备过程繁琐耗时，并大幅增加了生产成本。
牛樟树（Cinnamomum kanehirae Hay）是樟属植物的一种，也是野生牛樟芝唯一的天然寄主。牛樟树或其他樟属植物中存在一些促进樟芝生长、繁殖或活性产物合成的物质。本团队前期研究 了牛樟树木屑的4 种溶剂（水、甲醇、乙酸乙酯及石油醚）提取物对樟芝深层发酵无性产孢的影响，结果表明，只有牛樟树水提物（CWE）显著促进樟芝无性产孢，且在最佳质量浓度（60 μg/mL）下使樟芝产孢量较对照组（不添加CWE）提高58%左右。但前期研究未对CWE中促进樟芝无性产孢效应物进行分离及鉴定等深入研究。
为了进一步完善上述研究，扬州大学食品科学与工程学院的李华祥、戴嘉宁、杨振泉*等采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析法对CWE的不同有机溶剂萃取物进行成分分析，并对相关化合物促进樟芝无性产孢的效果进行验证，最终明确CWE中促进樟芝无性产孢的物质并优化其最佳添加量，为进一步提高樟芝深层发酵无性孢子产量及促进樟芝深层发酵工业化生产提供理论依据和实践基础。
01
牛樟树水提物醇沉上清和沉淀对樟芝产孢量的影响
由图1可知，CWE醇沉沉淀对樟芝产孢量无明显影响，而CWE醇沉上清明显促进樟芝无性产孢且促进效果与CWE相当。可见，CWE中的效应物主要存在于CWE醇沉上清中。
02
牛樟树水提物醇沉上清萃取物对樟芝产孢量的影响
由图2可知，10～50 μg/mL WTE对樟芝无性产孢均无任何促进效果，说明效应物已被萃取到有机溶剂中，在萃取剩余物中已无残留或残留量甚微；添加10～50 μg/mL的DCE对樟芝产孢亦无任何促进效果，相反，高质量浓度（50 μg/mL）的DEC明显抑制樟芝产孢，说明DCE中几乎不含效应物，甚至含有抑制樟芝无性产孢的物质；添加10～50 μg/mL的YZE和LFE均明显促进樟芝无性产孢，且LFE的促进效果优于YZE。其中，YZE的最佳添加质量浓度为50 μg/mL，此时樟芝最大产量（6.33×107 个/mL）较对照组提高35.35%；LFE的最佳添加质量浓度为30 μg/mL，此时樟芝最大产孢量（7.10×107个/mL）较对照组提高52.02%。上述结果表明，效应物主要存在于YZE和LFE中，且在LFE中的含量（质量分数）明显高于YZE。
03
上清液分级萃取组分LC-MS分析
为明确CWE中促进樟芝无性产孢的主要效应物，对CWE醇沉上清的4 个萃取组分进行LC-MS检测分析，每个组分中质量分数排名前10的物质信息见表1。
综合表1和图2的结果可知，LFE和YZE均明显促进樟芝无性产孢，而LFE中质量分数较高（10%以上）的物质分别为赤藓糖醇和7-甲氧基香豆素，YZE中质量分数较高（6%以上）的物质分别为甲吡唑、赤藓糖醇和甜菜碱。因此，效应物应为赤藓糖醇、7-甲氧基香豆素、甲吡唑和甜菜碱中的一种或几种。DCE和WTE均无任何促樟芝无性产孢效果，而DCE和WTE中质量分数最高（13%以上）的物质均为甲吡唑，因此，可以确定甲吡唑并非效应物。同时，高质量浓度的DCE明显抑制樟芝无性产孢（图2），可见甲吡唑对樟芝无性产孢可能有抑制作用。此外，YZE中质量分数最高的物质也是甲吡唑，而LFE中甲吡唑的质量分数相对较低（排名第6），这解释了LFE促进樟芝无性产孢的效果明显优于YZE的原因。YZE中质量分数排名前10的物质并无7-甲氧基香豆素，LC-MS检测7-甲氧基香豆素在YZE中的质量分数仅为0.37%。可见，7-甲氧基香豆素并非效应物。在促进樟芝无性产孢效果最好的LFE中，质量分数最高的物质为赤藓糖醇，达12.78%。在促进樟芝无性产孢效果仅次于LFE的YZE中，赤藓糖醇的质量分数排名第2，为6.78%。此外，有文献报道，以赤藓糖醇为碳源可以显著促进哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和棘孢木霉（Trichoderma asperellum）分生孢子的产生。因此，赤藓糖醇可能为CWE中促进樟芝深层发酵无性产孢的主要效应物；甜菜碱在YZE中的质量分数与赤藓糖醇相当，均为6%以上。在LFE中，甜菜碱的质量分数也在3%以上。因此，甜菜碱亦可能为效应物之一，但尚需进一步验证。
04
不同质量浓度赤藓糖醇和甜菜碱对樟芝深层发酵的影响
由图3可知，添加1.0 μg/mL甜菜碱对樟芝深层发酵无性产孢有轻微促进作用，最大产孢量较对照组提高7.36%，但二者之间并无显著差异。可见，甜菜碱对樟芝深层发酵无性产孢无显著促进作用。相反，高质量浓度（5.0 μg/mL）的甜菜碱对樟芝深层发酵无性产孢有明显抑制作用。此外，添加1.0、2.0 μg/mL的赤藓糖醇均明显提高樟芝深层发酵无性孢子产量。其中，添加1.0 μg/mL的赤藓糖醇时，最大产孢量达6.78×107 个/mL，较对照组提高55.17%，促进效果较为明显；添加2.0 μg/mL的赤藓糖醇对樟芝无性产孢的促进效果略低于1.0 μg/mL；但当赤藓糖醇的添加质量浓度高于5.0 μg/mL时，则对樟芝无性产孢表现出明显的抑制效果，产孢量大幅下降。
综上所述，赤藓糖醇确为CWE中促进樟芝深层发酵无性产孢的主要效应物，但促进效果具有严重的浓度依赖性。最适添加质量浓度范围为1.0～2.0 μg/mL。当添加质量浓度过低（≤0.5 μg/mL）时，无明显促进效果；当添加质量浓度过高（≥5.0 μg/mL）时，则表现出明显抑制效果。
结论
CWE中促进樟芝深层发酵无性产孢的主要效应物为赤藓糖醇，其最佳添加质量浓度为1.0 μg/mL，使樟芝产孢量较对照组提高55.17%。此外，1.0 μg/mL的赤藓糖醇还显著促进樟芝深层发酵过程中菌丝体生长及胞内多糖的合成，使胞内多糖产量较对照组提高260.13%，效果较为显著。本研究成果可大幅提高樟芝深层发酵工业化生产过程中种子制备效率及胞内多糖生产效率，对推动樟芝深层发酵工业化生产进程具有重要意义。
作者简介
杨振泉，扬州大学食品科学与工程学院教授，博士生导师，主要研究方向为功能乳酸菌发掘及其在有害生物因子生态防控中的应用及食品生物有害因子快速检测技术与应用。曾获全国商业科技进步一等奖、教育部科技进步一等奖、中华农业科技进步二等奖、扬州大学教学成果一等奖等，主持国家级项目6 项，省基项目8 项，发表SCI论文50余篇，获授权20余项。
李华祥 博士，扬州大学食品科学与工程学院讲师，食品生物技术教研室副主任）2017年6月，博士毕业于江南大学生物工程学院发酵工程专业，2018年5月入职扬州大学食品科学与工程学院。长期从事牛樟芝相关研究，精通丝状真菌发酵及活性物质分离。目前主要从事真菌发酵及食品质量安全与控制研究。主持国家青年自然科学基金项目和江苏省青年自然科学基金项目各1 项，已发表学术论文近30篇，其中SCI论文近20篇，获授权专利7 项。
本文《牛樟树水提物中促进樟芝无性产孢的效应物鉴定及其添加量优化》来源于《食品科学》2024年45卷第7期96-102页，作者：李华祥, 戴嘉宁, 王娟娟, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230728-317。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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