裙带菜（Undaria pinnatifida Suringar）作为我国重要的药用海藻和功能性食品，其多糖已被证实具有自由基清除能力、降血糖等活性。磷酸化修饰在增强多糖生物活性方面具有显著优势。磷酸化修饰可以通过改变多糖结构，包括分子质量、空间构象、分支度、糖苷键等，进而改变多糖生物活性，但结构特征对其生物活性的响却不尽相同。磷酸化修饰对裙带菜多糖生物活性的影响及其伴随的结构变化尚不明确。
广西科技大学医学部李瑶、熊彩明、冯书珍*等采用微波辅助酶法提取裙带菜多糖，经离子交换柱层析和凝胶柱层析分离纯化后进行磷酸化修饰，综合运用紫外吸收光谱、傅里叶变换红外光谱、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、高碘酸氧化及Smith降解法、刚果红实验、β-消去反应、碘-碘化钾实验对磷酸化裙带菜多糖进行结构表征，评价其修饰前后自由基清除能力和降血糖活性及其相关性，以期为裙带菜多糖构效关系研究提供理论依据和数据支撑，并为裙带菜功能性食品的开发和利用提供参考。由图1A可知，从20 g裙带菜中得到UPP约2.53 g，提取率为12.65%。UPP经DEAE-Cellulose 52型阴离子交换树脂分别用蒸馏水、NaCl溶液洗脱分离后，得到1 个多糖组分（UPP1），产率为21.20%，为0.05 mol/L NaCl溶液洗脱组分。UPP1再经Sephadex G-100凝胶层析柱进一步纯化，呈现单个对称的洗脱峰，记为组分UPP1a（图1B），其产率为55.91%。![]()
采用磷酸盐法对UPP1a进行磷酸化修饰，得到裙带菜多糖磷酸根的取代度为9.26。由图2可知，UPP1a及UPP1a-P在260、280 nm波长处均无明显吸收峰，说明磷酸化修饰前后的裙带菜多糖的核酸和蛋白质含量均相对较低。裙带菜多糖经磷酸化修饰后形成了化学键束缚，导致修饰后裙带菜多糖紫外吸收强度有所减弱，峰值降低。![]()
由表1和图3可知，裙带菜多糖修饰前后主体结构并未发生改变，UPP1a-P和UPP1a在3 670～3 220、3 000～2 800、1 700～1 400、1 200～1 000 cm－1均显示出多糖的特征吸收峰；与UPP1a相比，UPP1a-P分别在1 216、886 cm－1出现P＝O、P—O—C键的吸收峰，均提示存在磷酸基团，说明多糖磷酸化修饰成功。UPP1a-P在1 094 cm－1附近出现的吸收峰是吡喃环的醚键和羟基的共振吸收峰，由C—O—C不对称伸缩振动引起，890 cm－1附近出现的吸收峰由C—H的变角振动引起，是吡喃葡聚糖和β-型糖苷键连接的特征吸收峰，771 cm－1为吡喃糖对称环伸缩振动，在N—H的变角振动范围内有1 643 cm－1吸收峰，为蛋白质吸收峰，说明磷酸化修饰后的裙带菜多糖UPP1a-P是一种由β-糖苷键连接的吡喃型葡聚糖。
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通过MALDI-TOF-MS可知，UPP1a和UPP1a-P的相对分子质量均分布在5×103～8×104。其中，UPP1a的最大相对分子质量为77.3×103，修饰后的UPP1a-P相对分子质量增大，在5×103～1.8×104区间峰较明显，最大相对分子质量为94.4×103。通过高碘酸氧化实验，在223 nm波长处测吸光度，得到高碘酸消耗量标准曲线：y＝10.568 0x－0.001 1（R2＝0.999 1）。UPP1a-P能被高碘酸氧化，当反应时间达到144 h时，吸光度趋于平稳，反应结束（图4）。UPP1a-P经高碘酸氧化后，平均每摩尔糖残基消耗高碘酸0.507 mmol，并生成0.002 mmol甲酸。此过程中，高碘酸氧化产生了少量甲酸，说明UPP1a-P中存在1→6糖苷键。高碘酸消耗量大于甲酸生成量的2 倍，说明UPP1a-P结构中存在只消耗高碘酸而不生成甲酸的1→2,1→4糖苷键，还存在既不消耗高碘酸也不产生甲酸的1→3糖苷键。UPP1a-P经Smith降解后，检测出甘油、木糖、乙二醇和半乳糖（表2），说明UPP1a-P的多糖组分中存在1→6、1→2,1→4型糖苷键。进一步结合高碘酸氧化实验可知，UPP1a-P的主要连接方式为1→2、1→3、1→4和1→6，即UPP1a-P结构中存在0.504 mmol的1→2,1→4糖苷键、0.002 mmol的1→6糖苷键和0.494 mmol的1→3糖苷键。
由图5可知，随着NaOH浓度不断增大，UPP1a和UPP1a-P的最大吸收波长均显著大于刚果红。其中，UPP1a在0～0.5 mol/L浓度范围内最大吸收波长没有明显下降趋势，说明NaOH对UPP1a的结构未造成破坏，不存在三股螺旋结构。UPP1a-P在NaOH浓度为0.0～0.5 mol/L时最大吸收波长发生红移，说明UPP1a-P分子间作用力发生变化，具有三股螺旋结构。由图6可知，经NaOH处理后的UPP1a-P在240 nm波长处吸光度明显增大，表明UPP1a-P中含有—O—型糖肽键。
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由图7可知，UPP1a-P与KI-I2反应物的最大吸收峰在300 nm附近，而在565 nm波长处无最大吸收，说明UPP1a-P具有较长的侧链和较多的分支。![]()
由图8和表3可知，UPP1a-P和UPP1a对DPPH自由基、O2－ ·和·OH的清除作用均随质量浓度的增加而增加，磷酸化后的裙带菜多糖自由基清除能力显著高于磷酸化前（P＜0.05），具体表现为：在0～5 mg/mL质量浓度范围内，UPP1a-P对3 种自由基清除率的IC50均显著低于UPP1a。其中，UPP1a-P对3 种自由基清除率的IC50分别为（1.19±0.43）、（2.24±1.63）、（1.11±0.13）mg/mL，UPP1a分别为（118.00±0.74）、（5.14±0.62）、（335.60±0.39）mg/mL（P＜0.05）。在5 mg/mL质量浓度下，与UPP1a相比，UPP1a-P对DPPH自由基、O2－ ·和·OH的清除率显著提高34.76%、12.30%、76.05%。
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由图9和表3可知，UPP1a-P和UPP1a对α-葡萄糖苷酶的抑制作用均随质量浓度的增加而增加。当质量浓度达到20 mg/mL时，UPP1a-P和UPP1a对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分别为95.40%、91.70%，UPP1a-P较UPP1a抑制率提高3.70%；在0～20 mg/mL，UPP1a-P对α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50显著低于UPP1a（P＜0.05），分别为（0.07±0.05）、（2.31±0.60）mg/mL，表明磷酸化修饰可以增强裙带菜多糖的降血糖活性。
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由图10、11可知，磷酸化修饰前后裙带菜多糖对自由基的清除能力与其降血糖活性间存在高度显著正相关（P＜0.001），其中，DPPH自由基、O2－ ·的清除作用显著影响降血糖活性（P＜0.05），但·OH的清除作用与降血糖活性间无显著相关性（P＞0.05）。
磷酸化修饰均显著增强裙带菜多糖DPPH自由基、O2－ ·、·OH的清除能力；磷酸化修饰后的裙带菜多糖降血糖活性显著高于修饰前，说明磷酸化修饰适用于改善裙带菜多糖生物活性。同时，降血糖活性与自由基清除能力间存在一定相关性，有研究表明，DPPH自 由基、·OH的清除能力可显著影响葛根多糖的降血糖活 性，但裙带菜多糖的降血糖活性与DPPH自由基、O2－ ·的清除作用具有显著相关性，与·OH清除能力无显著相关性，分析原因可能与裙带菜多糖对O2－ ·和DPPH自由基的清除能力较强、·OH清除能力相对较弱有关（表3）。磷酸化修饰后裙带菜多糖活性的增强可能与其化学结构改变有关。多糖最佳生物活性的发挥有赖于其相对分子质量的大小。相对分子质量较大的UPP1a-P具有更高的自由基清除能力和降血糖作用，这可能是由于相对分子质量较低时，多糖上所带的活性基团太少而无法形成有效的活性空间结构，多糖生物活性相对较弱。三股螺旋结构是多糖高级结构中最具活性的空间构型，引入磷酸基团后，裙带菜多糖出现三股螺旋结构，使多糖能够与三股螺旋结构中的1→3糖苷键结合，提高其自由基清除能力和降血糖活性。此外，UPP1a-P具有较长的侧链和较多的分支结构，且单糖之间的连接方式主要为1→3、1→2,1→4、1→6型糖苷键。有研究表明，分支较多、支链较长的多糖生物活性高，同时，多糖以1→3、1→4、1→6糖苷键连接时具有 更高的自由基清除能力和降血糖能力。裙带菜多糖经磷酸化修饰后出现磷酸基团的特征吸收峰，修饰后裙带菜多糖的最大相对分子质量为94.4×103，具有三股螺旋结构，是一种由β-糖苷键连接的吡喃型葡聚糖。其中，多糖与氨基酸主要通过—O—型糖肽键相连，单糖之间主要由0.494 mmol的1→3型、0.504 mmol的1→2,1→4型和0.002 mmol的1→6型糖苷键连接，且具有分支结构。磷酸化修饰前后的裙带菜多糖均具有一定的自由基清除能力及降血糖活性，其中，UPP1a-P对DPPH自由基、O2－ ·和·OH的清除率及α-葡萄糖苷酶的抑制率均显著强于裙带菜多糖，表现出更优的自由基清除能力和降血糖活性。此外，自由基的清除能力与降血糖活性间显著正相关，且DPPH自由基和O2－ ·是影响裙带菜多糖降血糖活性的主要因素。裙带菜多糖经磷酸化修饰后，化学结构发生改变，生物活性显著增强，可考虑采用磷酸化修饰方法制备具有自由基清除能力和降血糖活性的裙带菜多糖，具有广阔的应用前景，但磷酸化修饰裙带菜多糖的构效关系仍有待进一步研究。冯书珍，广西科技大学医学部副教授，硕士生导师。2012.9-2016.7就读于中国科学院大学，获理学博士学位。主要从事微生物驱动化学元素循环、微生物代谢及药用植物微生物分子生物学等方面的研究。主持国家自然科学青年基金项目、广西科技基地与人才专项、广西青年基金项目、广西重大产业技术创新项目（子课题）等国家级、省部级各类科研项目8 项，以第一/通信作者在Science of the Total Environment、Applied Microbiology and Biotechnology、《环境科学》、《生态学报》、《食品科学》等杂志发表相关论文20余篇。入选广西高校“千名骨干教师培育计划”，获全国医学（医药）院校青年教师教学基本功比赛、广西高校青年教师教学竞赛二等奖。
李瑶，广西科技大学理学院硕士研究生，女，1998年5月6日生，2021年就读于广西科技大学理学院应用统计专业，研究方向为生物统计。以第一作者在核心期刊上发表论文2 篇，获得2022年度广西科技大学优秀研究生、2022年度广西科技大学科技活动先进个人、第十二届正大杯全国大学生市场调查与分析大赛全国三等奖、第五届应用统计专业学位研究生案例分析大赛全国三等奖。本文《磷酸化裙带菜多糖的制备及结构表征和生物活性分析》来源于《食品科学》2024年44卷第7期35-42页，作者：李瑶, 熊彩明, 张佳乐, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230803-020。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：南伊，责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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