1 不同溶剂提取效果比较
2 单因素试验结果
超声辅助提取已被证明可以提高目标成分的提取率。影响超声辅助提取效率的因素包括提取时间、固液比、溶剂含水量、提取温度等，本研究通过单因素试验进行考察并优化，结果如图2所示。
由图2A可知，随着超声时间的延长，待测物提取率增加，在10～40 min内整体呈现先下降后上升的趋势。其中，在10 min和40 min时提取效果最好，总体峰面积超过1×108，且不存在显著差异。超声的空化作用以及机械作用可以加速目标物从茶叶中向提取试剂中转移，同时有可能对目标物存在破坏作用，所以在20 min时提取效果仅好于5 min。考虑到时间成本，最终确定10 min为最佳提取时间。
由图2B可知，固液比的改变对提取效果影响较大。随着固液比的增大提取效果降低，固液比1∶10时，提取效果最好，总体峰面积超过1.4×108。茶叶中的化合物在固液比1∶10时已经全部溶出，最终采用固液比1∶10。
由图2C可知，茶叶目标物的提取效果随着甘油含水量的增加呈先增后降的趋势。当甘油含水量达到50%时提取效果最好，总体峰面积超过1.6×108，约是含水量70%（0.976×108）和30%（0.979×108）时提取峰面积的1.6 倍。甘油与水可以任意比例互溶，加入水后黏度降低，活性物从茶叶转移到提取试剂的阻力变小。当含水量高于50%时，提取试剂极性与目标物极性相差较大，提取效果降低。在甘油的存在下水溶液的极性和黏度需要达到平衡，因此，最终选择甘油的含水量为50%。
3 液相色谱-质谱条件的优化
色谱条件的优化主要包括流动相组成、洗脱梯度以及色谱柱的选择。参考课题组前期的研究，本实验采用Hypersil GOLD C18色谱柱对茶叶中的儿茶素、黄酮和酚酸等酚类物质进行分离，流动相为0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B），对洗脱梯度进行微调，具体见1.3.2.2节。前期工作中，课题组采用亲水作用的Syncronis HILIC色谱柱检测茶叶中的生物碱、核苷、核苷酸、氨基酸4类亲水性物质。亲水色谱柱的柱效通常随流速增大而降低，不利于快速色谱分离，此外该类型色谱柱需要较长的柱平衡时间。Hypercarb色谱柱是一类采用多孔石墨碳作为填料的C18色谱柱，对极性化合物有较强的保留能力，对结构相近物质能很好分离，有较宽的pH值范围并且高温条件下仍能保持稳定性。因此，本研究选择Hypercarb C18色谱柱用于有机酸、生物碱、核苷、核苷酸、氨基酸5 类亲水性成分的分离分析，通过条件优化，最终确定流动相为0.2%甲酸＋1 mmol/L甲酸铵（A）和乙腈（B）。应用优化的UPLC-QQQ-MS/MS条件，对7 类共130 个化学成分进行分离分析，结果如图3所示，可以看出这些成分均获得了良好分离且具有较好的峰形，为准确定量分析奠定了基础。
4 方法学验证
检测限、定量限、精密度、加标回收率、准确度以及基质效应结果见表1、2，7类化合物均在0.018～96.150 µ g /m L内呈现良好的线性关系（0.4～12 000 mg/kg，R2≥0.990）。检测限和定量限分别为0.000 1～4.332 1 mg/kg与0.000 2～12.996 3 mg/kg，表明该方法具有很高的灵敏度。在高、中、低3个质量浓度下，日内、日间精密度分别为0.04%～14.94%和0.35%～14.90%，表示仪器稳定性较好，实验结果比较可靠。目标物的加标回收率以及RSD分别在80.10%～121.12%和0.26%～25.68%之间，证明该方法准确度较高。基质效应在72.00%～118.27%之间，结果可被接受。以上结果表明本研究建立的甘油提取结合UPLC-QQQ-MS/MS定量分析方法有良好的准确性和精密度。
5 方法的应用
将建立的方法应用于实际茶叶样本及其副产物的化学成分定量分析，首先采用甘油结合超声处理提取多类化学成分，然后利用验证后的UPLC-QQQ-MS/MS进行定量分析。定量结果如表3所示，共检测出酚类成分41种、有机酸6种、氨基酸16种、生物碱1种、核苷2种，未检出的成分可能是未提取到或是其含量低于检测限。
将各检测到的化学成分含量相加，加合总含量如图4所示。可以看出，不同样本的总含量相差较大，在86 622.93～219 652.94 mg/kg范围内。其中，加合总含量最高的样本分别为普洱生茶6号（219 652.94 mg/kg）、普洱生茶4号（169 741.61 mg/kg）和黄片（151 354.49 mg/kg）。所有样本中，普洱生茶5号（112 235.94 mg/kg）和茶渣（86 622.93 mg/kg）的加合总含量较低。
定量结果表明，茶叶及其副产物的样本中含量较高的化学成分包括表儿茶素（2 399.42～21 207.83 mg/kg）、表没食子儿茶素（1 369.47～7 934.14 mg/kg）、表儿茶素没食子酸酯（5 168.42～26 854.46 mg/kg）、EGCG（6 4 84.68～2 8 8 44.07 mg/kg）、3-没食子酰基奎宁酸（2 230.36～15 722.18 mg/kg）、茶氨酸（5 901.84～1 4 458.35 mg/kg）、咖啡因（6 506.29～1 2 017.14 mg/kg）、奎宁酸（5 649.48～29 529.46 mg/kg）。具体含量对比如图5所示，黄片和茶渣中的化学成分比较丰富。例如，茶渣中上述物质总含量较低，但是其咖啡因含量（9 969.66 mg/kg）仅次于普洱生茶7号（12 017.14 mg/kg）。咖啡因是茶叶中提供苦涩味的主要物质之一，对人体具有一定的促兴奋作用，还具有一定的药理功能。普洱生茶3、6、7、8号以及黄片的茶氨酸含量均大于13 000 mg/kg，说明茶氨酸是普洱生茶及其副产物中含量最高的氨基酸，茶氨酸约占茶叶氨基酸总量50%～60%，具有甜味和鲜爽味，是茶叶的滋味物质。氨基酸成分中除茶氨酸外，精氨酸（1 114.87～3 679.68 mg/kg）、天冬氨酸（1 344.32～3 459.21 mg/kg）、谷氨酰胺（796.21～1 653.41 mg/kg）、天冬酰胺（401.38～1 938.94 mg/kg）和谷氨酸（2 387.83～6 554.72 mg/kg）的含量也较高。儿茶素类化合物是茶叶中的主要功能成分，占茶叶干质量的12%～24%，是茶汤苦涩味的呈味物质和茶汤的呈色物质。普洱生茶2、3、4、6号总儿茶素含量超过60 000 mg/kg，普洱生茶1、5、7、8号和黄片总儿茶素含量介于40 000～60 000 mg/kg之间，茶渣含量为15 830.05 mg/kg。
黄片是指加工过程中外观不满足生产标准，而被人工剔除用于其他生产的茶箐。本研究的结果表明，黄片中化学成分的含量与正常茶叶样本相当，如其EGCG、咖啡因、茶氨酸的含量分别为18 806.25、9 969.66 mg/kg和14 458.35 mg/kg，甚至高于某些正常茶叶样本的含量。茶渣是茶叶加工中产生的另一类主要副产物，包括挑拣剩下的茶末、茶梗。定量结果表明茶渣中含量较高的化学成分包括表儿茶素（2 399.42 mg/kg）、表没食子儿茶素（1 369.47 mg/kg）、表儿茶素没食子酸酯（5 168.42 mg/kg）、EGCG（6 484.68 mg/kg）、3-没食子酰基奎宁酸（2 230.36 mg/kg）、木犀草素（44.91 mg/kg）、精氨酸（1 163.86 mg/kg）、天冬氨酸（1 374.07 mg/kg）、茶氨酸（5 901.84 mg/kg）、咖啡因（9 969.66 mg/kg）、奎宁酸（12 322.43 mg/kg）、乳酸（10 107.8 mg/kg）和草酸（7 542.81 mg/kg）。因此，茶渣作为茶叶加工的副产物，同样含有丰富的生物活性成分，存在进一步利用的价值。
结 论
实习编辑：俞逸岚；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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