医疗相关卵巢损伤主要是指手术或放化疗对卵巢结构和功能所造成的损伤，可见于妇科良恶性肿瘤的治疗过程中。环磷酰胺是临床上最常用的药物之一，但其作为烷化剂是公认的对卵巢损伤最大的化疗药物。一些天然产物被证明可对环磷酰胺诱导的卵巢损伤起到有效的保护作用，具体效果取决于所含有效单体成分的种类与含量。
松花粉是松科植物马尾松、油松或其同属植物的雄性生殖细胞，是一种药食同源的原料，目前已在扶正化瘀片（胶囊）、清肺止咳散和哮喘丸等中成药中广泛应用。本课题组的前期研究证实松花粉可以有效保护环磷酰胺诱导的卵巢损伤。通过按照分子质量大小和化合物溶解性差异等理化性质对松花粉组分进行分离，进而验证各组分对卵巢的保护效果，结合统计分析可以筛选效应组分以及确定其相应的主要干预途径。
烟台理工学院食品与生物工程学院、烟台新时代健康产业有限公司的刘其耸和江南大学食品学院陈阳、曾茂茂*等分析松花粉水提物、水提大分子化合物（＞5 kDa）、乙醇提物和乙醇提小分子化合物（＜5 kDa）4 种松花粉提取物的总糖、粗多糖、总酚和总黄酮等组成，并探讨各提取物对摄入环磷酰胺大鼠的卵巢保护作用，包括卵巢形态、抗氧化能力、细胞凋亡能力和抗炎能力等，进一步通过统计分析对松花粉的效应组分进行筛选，旨在对后续准确解析松花粉内对于卵巢损伤具有保护作用的药效物质及其体内作用机制提供指导。
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松花粉4 种不同提取物的成分分析
松花粉4 种提取物中的总糖、粗多糖、总酚和总黄酮含量如表3所示。可以发现，水提物中的糖类物质的含量较醇提物更高，而酚类及黄酮类物质则相反，在乙醇提物中含量更高（P＜0.05）。通过使用5 kDa的膜超滤后的水提大分子化合物中含有更多的糖类，且粗多糖相对总糖占比由22.59%增加至28.65%，总黄酮流失更为严重；乙醇提小分子化合物中总酚、总黄酮含量有所富集，总糖含量下降最为显著。以往研究中证实植物多糖及多酚、黄酮类物质都可以对环磷酰胺诱导的卵巢损伤起到保护作用，本研究制备所得的4 种提取物在这些主要活性成分含量上差异显著（P＜0.05），通过验证4 种提取物对环磷酰胺诱导卵巢损伤的保护效果，可以为后续筛选松花粉中确切具有卵巢保护作用的单一组分糖类抑或是多酚黄酮类的药效物质提供指导，并可通过不同组分作用途径的差异为更加科学的食品或药品复配提供理论依据。
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松花粉提取物对卵巢损伤大鼠卵巢形态的影响
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松花粉提取物对环磷酰胺诱导卵巢损伤大鼠卵巢抗氧化能力的影响
如图2所示，相较于空白对照组，模型组的卵巢T-AOC显著下降了12.52%，GSH-Px、SOD和CAT活力显著下降了50.05%、53.80%和63.75%，MDA水平显著上升了103.38%（P＜0.05）。与模型组相比，除水提大分子化合物组外，其余各组的卵巢抗氧化能力均有显著提升，其中提升最大的是乙醇提小分子化合物组，其次是乙醇提物，两组分别将T-AOC、GSH-Px活力、SOD活力和CAT活力显著提高了25.81%、16.03%，109.90%、104.31%，120.63%、91.62%和237.09%、138.42%，并将MDA水平显著降低了48.43%、53.42%（P＜0.05）。乙醇提物提升机体抗氧化能力的效果也优于水提物，并且乙醇提物和乙醇提小分子化合物的卵巢GSH-Px和CAT活力无显著差异（P＞0.05）。水提大分子化合物组在各项抗氧化指标方面的表现不如水提物组，表明水提物对卵巢抗氧化方面的提升可能更多是受水溶性小分子化合物的影响。对于水溶性多糖大分子、醇溶性多酚和黄酮等小分子提升机体内抗氧化酶活力及降低MDA含量均有所报道，但本研究发现相对模型组而言，松花粉水提大分子化合物提升机体内抗氧化酶活力及降低脂质氧化不显著（P＞0.05），表明松花粉多糖等水溶性大分子物质与小分子化合物在通过调节卵巢氧化应激保护卵巢机制方面存在差异，这可能是松花粉多糖等水溶性大分子物质无法进入胞内作用于相关靶点的原因。
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松花粉提取物对卵巢损伤大鼠卵巢抗炎能力的影响
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松花粉4 种提取物对卵巢损伤大鼠卵巢抗细胞凋亡能力的影响
如表4所示，模型组的卵泡颗粒细胞凋亡指数为（83.40±5.37）%，远高于其余各组（P＜0.05）。松花粉原粉、水提物、乙醇提物、水提大分子化合物、乙醇提小分子化合物分别将凋亡指数显著降低了50.71%、62.04%、48.29%、55.42%和51.66%，表明松花粉各组分都对调控卵巢颗粒细胞凋亡有积极影响。相比水提物组，水提大分子化合物组凋亡指数升高了11.78%（P＜0.05）；相比醇提物组，醇提小分子化合物组的凋亡指数下降了6.91%（P＜0.05），表明小于5 kDa的小分子化合物能有效减少颗粒细胞的凋亡。水提物细胞凋亡指数显著低于醇提物，这可能与有效小分子化合物水溶性高于醇溶性，因而在水提物中的含量高于在醇提物中的含量有关。
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4 种松花粉提取物对卵巢损伤大鼠卵巢凋亡蛋白表达的影响
在研究的5 种凋亡相关蛋白中，Bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白，Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3是促凋亡蛋白，其中Cleaved Caspase-3是Caspase-3的活化形式，仅存在于正在凋亡的细胞中。如图4所示，模型组较空白组的Bcl-2蛋白含量下降，Bax、Caspase-3和CleavedCaspase-3含量均显著上升。与模型组相比，松花粉原粉及4 种提取物组均显著上调了Bcl-2蛋白表达，下调了Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白表达（P＜0.05）。研究认为，Bcl-2与Bax的比值对细胞接受凋亡信号刺激后是否存活起关键作用。本研究结果显示，乙醇提物组与乙醇提小分子化合物组的Bcl-2/Bax值显著高于水提物组和水提大分子化合物，而Cleaved Caspase-3的表达则显著低于水提物组与水提大分子化合物组（P＜0.05），说明乙醇提物与乙醇提小分子化合物调控卵巢抗凋亡蛋白表达能力最强，其次是水提物和大分子水提取物。卵巢凋亡蛋白表达与颗粒凋亡指数的结果存在差异，表明4 种松花粉提取物在通过调控凋亡蛋白表达，进而减少卵巢细胞凋亡的机制方面存在较大差异。
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4 种松花粉提取物对卵巢损伤大鼠影响的聚类分析
图5A显示，模型组与其余组分为两大簇，表明4 种提取物都可以一定程度上缓解卵巢损伤。其中，阳性对照组与空白组分为一簇，与乙醇提小分子化合物和乙醇提物归为一簇，与水提大分子化合物、松花粉原粉和水提物归为一簇。聚类分析的结果证明了乙醇提小分子化合物和醇提物具有比松花粉原粉、水提物和水提大分子化合物更好的效果。图5B的相关性分析结果显示，总酚和总黄酮与闭锁卵泡间形成负相关，总糖和粗多糖并未表现出与闭锁卵泡的任何相关性；此外，总酚和总黄酮在提升机体抗氧化力、降低脂质氧化以及抑制促凋亡蛋白表达方面的效果好于总糖和粗多糖，这在一定程度上解释了富集多酚和黄酮的乙醇提小分子物和乙醇提物具有更好卵巢保护作用的现象。但值得注意的是，糖类与TNF-α具有更强的负相关特性（P＜0.05），即清除促炎因子TNF-α可能是松花粉多糖发挥保护卵巢作用的途径。
结论
本文《不同松花粉提取物对环磷酰胺诱导大鼠卵巢损伤的保护作用》来源于《食品科学》2024年45卷第6期105-112页，作者：刘其耸, 陈阳, 杨长军, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230504-022。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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