前不久，在经历了数年“封禁风云”后，美国FDA宣布在2025年7月31日前对NMN的销售不再设限！战战兢兢如NMN，可算在备受争议中迎来了喘息之机。
但别高兴的太早，NMN身陷封禁之局也不只因简单的补剂or药物的身份之争，含量有没有虚标？足够安全了吗？想彻底摆脱“禁售名单”，对NMN，不多下点功夫可不行！
在NMN“性命攸关”的时刻，我国学者於邱黎阳教授及其团队带来了令人振奋的好消息！他们发明了一种可实时监测活细胞内NMN动态变化的蛋白探针。有了它，科学家们表示：再也不用半知半解地去猜测细胞如何利用NMN了，这得力武器，可真给力[1]！
所谓精雕细琢出好物，在之前的NAD+研究史中，并非没有检测NMN及其相关代谢物的方法，但今天的主角，同时满足抗干扰、高灵敏、可定位和可实时监测等一系列优良特质，并因此脱颖而出。
它，就是历经迭代改良和精心打磨之后，专为检测细胞内NMN而设计的NMN蛋白探针——NMoRI。
图注：NMoRI原理图
NMoRI是一个对NMN十分敏感且特异的蛋白质结构，其两端分别链接了一个发射蓝光的荧光素酶（cpNLuc）和一个与之共振并发射红光的红色荧光蛋白（RFP），cpNLuc和RFP之间的BRET（生物发光共振能量转移）效率可通过光谱监测。也就是说，只要待测物能让探针两端的cpNLuc和RFP相对位置变化，我们就能根据光谱测量其浓度。
在遇到NMN之前，cpNLuc和RFP遥遥相望，BRET信号很低。但当NMN结合NMoRI后，情况显然不同了：NMoRI的构象改变使cpNLuc和RFP距离拉近，能量转移效率增加，BRET效率增强，表现为NMN浓度依赖的BRET信号变化。
通过监测BRET信号强度来定量分析环境中的NMN浓度，恰是NMoRI的核心技术所在。
图注：NMN结合诱导NMoRI构象变化及使蛋白质支架N端和C端之间的距离被拉近
NMoRI能成功利用构象变化实现NMN“行踪捕获”很棒，但更棒的是其对NMN的高特异性优势：探针对其他NMN类似物没有显著响应，受自发荧光和pH等相关干扰同样很小。NMoRI 宣言：只为NMN而心动，误认其他分子？不存在的！”
图注：NMoRI对NMN特异性高，对其他类似物等无显著响应
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为了检验NMoRI到底好不好用，研究者们在人类胚胎肾细胞系HEK 293T细胞上开展了实验，结果显示，NMoRI完美揭示了在不同NAD+前体（NAM、NMN、NMNH、NR、NRH）存在下细胞摄取NMN的动态轨迹：
对于NMN，NMoRI的胞内BRET信号在4分钟内迅速增加并呈浓度依赖性，表明NMN能够被细胞迅速摄取；
至于其他前体，能在胞内快速转化成NMN的NR和NRH也引起了NMoRI信号的快速增加，但NA和NAM在10分钟内未能产生良好的响应，这可能与细胞摄取效率和不同前体转化为NMN的差异有关。
图注：HEK 293T细胞暴露于不同浓度的NAD+前体中时NMoRI 的BRET信号强度
进一步研究显示，当抑制转化过程中的关键帮手CD73（将胞外NMN转化成NR的酶）和ENTs（核苷转运蛋白）后，细胞摄取和转化NR和NRH的信号不再明显，但NMN的摄取信号依旧显著。通过NMoRI，研究者们明确证实了细胞摄取NMN的多机制共存特点。到底哪种前体更有效，测试一下便知道。
图注：NAD+前体的主要运输途径（左）；抑制CD73和ENTs后对NR和NRH转化为NMN的影响（右）
那么问题来了：NMN被细胞摄取之后，如何才能探查其在亚细胞结构中的分布呢？答案其实不复杂，只需给NMoRI装上精准的定位器——细胞器靶向肽，就能轻松实现追踪。
在为表达亚细胞蛋白探针的HEK 293T细胞建立校准曲线（用于确定探针信号与NMN实际浓度的关系）后，研究者发现，自然状态下HEK 293T细胞质中的NMN水平为3.07 μM，细胞核中为3.65 μM，线粒体中为6.16 μM。而且，大多数NAD+前体能显著增加这些部位的NMN水平。
图注：HEK 293T细胞校准曲线的建立（上）；NAD+前体显著增加了亚细胞结构中的NMN水平（下）
能实时追踪细胞摄取NMN的动态路径，还能精确定量亚细胞结构中的NMN水平，在探索细胞如何利用NMN的道路上，NMoRI，堪称实力型选手！
说到底，不管是细胞摄取NMN还是量化NMN水平，一切关注点还是为了咱那与衰老和寿命都息息相关的NAD+。但值得注意的是，“多多益善”其实并不适合NMN，越来越多的证据表明，NMN/NAD+的比例增加有可能激活SARM1蛋白，引发神经系统疾病。
在NMoRI的帮助下，研究者惊讶地发现，部分强效增加NAD+的前体物质（如NMNH和NRH）可显著增加NMN/NAD+的比例，并激活SARM1（cADPR水平增加是SARM1激活的指标），尤其在高表达SARM1的细胞，如SH-SY5Y中，更加明显。
图注：不同NAD+前体对NMN/NAD+比例和cADPR的水平的影响，SH-SY5Y细胞增加cADPR更明显
除了一众NAD+前体物质，NMNATs（NAD+合成酶）家族、其他蛋白质如NudtX水解酶和一些过氧化物酶体膜蛋白（如Pxmp2）在维持NMN/NAD+比例的平衡中同样扮演着关键的角色：
比如NMNATs在细胞内负责将NMN转化为NAD+，并调节脂肪细胞分化等过程。NMoRI信号显示，敲低NMNATs表达后，细胞质中NMN水平显著增加，反之过表达它们，NMN水平下降。
图注：NMNATs表达的变化对细胞内NMN、NAD+和NMN/NAD+比例的影响
在这样的场景下，NMoRI的存在价值愈发凸显：能帮助研究团队精密把控细胞内的NMN水平，在安全的基础上保障抗衰收益最大化。随着NMN/NAD+比例失衡在激活SARM1中的关键作用被日益强调，NMoRI的加入，无疑将为这份重视带来巨大的可行动性。
而你，我的朋友，离NMN精准抗衰的未来或许就缺这么一个淬炼而归的好帮手！
[本文的名称是《Quantitative dynamics of intracellular NMN by genetically encoded biosensor》，发表于国际分析化学权威杂志《Biosensors and Bioelectronics》 （https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116842），通讯作者是中国科学院深圳先进技术研究院於邱黎阳教授和中山大学肿瘤防治中心Kaijing Liu。第一作者是Liuqing Chen。本研究资助来源：中国国家重点研发计划（2021YFF1200300）、国家自然科学基金（22207118、22307135）、广东省重点领域研发计划（2023B1111030002）、广东省教育厅普通高校重点领域研发项目（2022ZDZX2071）、深圳市科技创新计划（JCYJ20220818100804009、ZDSYS20210623091810032）、广东省自然科学基金（2023A1515010715）、中国科学院深圳先进技术研究院]
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