摘要:
水凝胶内部不同分子的竞争性结合可促进水凝胶与周围环境之间的动态交换。控制这些分子的螯合和释放速率的能力将增强水凝胶的功能性，并能够靶向特定的任务。在此，我们报道了一种具有两种不同孔径的胶体水凝胶的设计，以实现分阶段的、扩散控制的清除和经历竞争性结合的分子的释放动力学。对CpG寡脱氧核苷酸（ODN）和人表皮生长因子（hEGF）这两种对水凝胶的季铵基团表现出不同亲和力的分子显示了分阶段的清除和释放策略。从周围环境中快速清除ODN是通过扩散通过亚微米大小的水凝胶孔发生的，而从水凝胶中延迟释放hEGF是通过其扩散通过纳米大小的孔控制的。实验结果与模拟结果很好的相符。阶段性ODN−hEGF交换的重要性通过双重抗炎和组织增殖水凝胶性能得以强调。
机理：
在目前的工作中，我们设计了一种由含有纳米尺寸孔的微凝胶颗粒组成的胶体水凝胶。微凝胶交联成宏观凝胶，从而产生亚微米大的空隙。已经报道了用于释放不同类型分子的微凝胶衍生的水凝胶; 然而，对经历竞争性结合的分子的运输的控制，特别是它们的分阶段隔离和释放，仍然未被探索。作为一对竞争性结合分子，我们选择了CpG寡脱氧核苷酸（ODN），一种在慢性伤口中诱导炎症的DNA片段，和人表皮生长因子（hEGF），一种促进伤口愈合的蛋白质。这些分子与水凝胶中的季铵基团具有不同的结合常数。由于竞争性结合通常在几秒钟内发生，我们假设这些分子的扩散将是周围介质和水凝胶之间发生的动态ODN-hEGF交换的限速步骤。我们显示了通过大的水凝胶孔和持续（缓慢）释放的hEGF封装在微凝胶通过扩散通过纳米尺寸的孔，从周围介质中的水凝胶的快速ODN隔离与模拟的结果一致。通过显示所设计的水凝胶增强的抗炎和组织增殖性能，验证了动态ODN-hEGF交换（两阶段过程）的重要性。
图文简介
方案1：水凝胶中的动态交换过程的说明：（a）动态交换之前的水凝胶，（B）A和B的竞争性结合，和（c）动态交换之后的水凝胶
图1 ：结构分级水凝胶的合成。(a)水凝胶制备示意图。步骤1.通过CS-g-pAETMAC共聚物与TPP的交联组装微凝胶。步骤2.通过微凝胶和a-PEG聚合物之间的交联形成宏观凝胶。(b)在σpAETMAC = 103、cCS/cTPP = 100条件下制备并用乙酸双氧铀染色的cMG的代表性TEM图像。刻度条为100 nm。(c)在ccMG = 2.0 wt %和ca-PEG = 8.0 wt %条件下制备的cMG-凝胶的代表性SEM图像。比例尺为1 μm。(d)CS分子上不同σpAETMAC值下cMG的dp，1变化与cCS/cTPP作图。(e)绘制了不同ccMG下cMG-Gel的dp，2变化与ca-PEG的关系图。(f)具有不同组成的cMG-凝胶的dp，1/dp，2比率的变化。数据点旁边的数字对应于孔径dp，1和dp，2，用逗号分隔。虚线用于目视引导。
图2：hEGF和ODN与水凝胶的结合。(a)将hEGF分子添加到PBS缓冲液中的cMG、a-PEG或ODN（[I] = 150 mM）时的量热响应。(b)将ODN分子加入PBS缓冲液中的cMG、a-PEG或hEGF后的量热响应。(c)在将ODN加入hEGF饱和的cMG的悬浮液或将hEGF加入ODN饱和的cMG的悬浮液中时的量热响应。实线是单点模型与用于估计热力学参数的实验数据的拟合。
图3 ：水凝胶对ODN的隔离和hEGF的释放。(a)在2.0 mL PBS缓冲液中的1.6 μM ODN溶液中浸泡不同时间间隔的0.2 mL负载有1.0 μM hEGF的cMG 38-Gel 183的荧光显微镜图像。ODN和hEGF的位置分别使用绿色（λem = 525 nm）和红色（λem = 570 nm）荧光发射可视化。虚线显示凝胶-溶液界面。比例尺为500 μm。(b)ODN和hEGF沿着穿过凝胶-溶液界面的线在不同时间间隔的荧光强度变化，相对于离界面的距离作图。（c-e）1.0 mL cMG 38-Gel 632、cMG 38-Gel 183和cMG 19-Gel 166的ODN摄取和hEGF释放曲线，这些cMG 38-Gel 632、cMG 38-Gel 183和cMG 19-Gel 166含有浸入5.0 mL PBS缓冲液中的1.6 μM ODN溶液中的1.0 μM hEGF。(f)具有不同组成的水凝胶的ODN摄取和hEGF释放的半衰期（τ）。括号显示统计学比较（t检验），* 和ns分别表示p < 0.001 and p >0.05。
图4 ：hEGF−ODN交换的数值模拟。(a)在不同dp，1下预测ODN摄取的半衰期τODN，vs dp，2。(b)在不同dp，2下τODN与dp，1的预测。(c)预测hEGF释放的半衰期，τEGF vs dp，2在不同的dp，1。(d)在不同dp，2下预测τEGF vs dp，1。(e)热图显示在不同dp，1和dp，2下的比率τEGF/τODN。在（a-d）中，实线是模型（圆圈）对预测数据的拟合。箭头上的数字对应于拟合的指数。
图5：抗炎水凝胶性能。(a)在存在或不存在cMG 19-Gel 166的情况下，在含有ODN的培养基中孵育4小时的巨噬细胞的荧光显微镜图像。箭头表示ODN与内溶酶体区室的共定位。刻度尺为10 μm。(b)用（i）PBS、（ii）PBS中的ODN溶液或（iii）PBS中的ODN溶液和cMG 19-Gel 166处理的巨噬细胞中细胞内ODN的平均荧光强度。(c)用（i）PBS、（ii）PBS中的ODN溶液、（iii）PBS中的ODN和hEGF混合物、（iv）cMG 19-Ge 166、（v）PBS中的ODN溶液和cMG 19-Ge 166、或（vi）PBS中的ODN溶液和负载hEGF的cMG 19-Ge 166处理72小时的巨噬细胞的TLR 9的相对基因表达。（d，e）在（c）中处理72小时后，巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6。培养基中ODN浓度为1.6 μM。PBS溶液和cMG 19-Gel 166的体积为0.2 mL，培养基的体积为2.0 mL。括号显示统计学比较（单因素ANOVA），* 和ns分别表示p < 0.001 and p >0.05。
图6：水凝胶的伤口愈合性能。(a)暴露于各种处理条件下48小时的真皮成纤维细胞层中划痕的明视野图像。划痕区域以浅绿色表示。比例尺为200 μm。(b)暴露于（i）PBS、（ii）hEGF的PBS溶液、（iii）hEGF和ODN的PBS混合物、（iv）cMG 19-Gel 166、（v）hEGF负载的cMG 19-Gel 166或（vi）ODN的PBS溶液和hEGF负载的cMG 19-Gel 166 48小时后划痕面积的减少。(c)在如（B）中48小时的各种处理下成纤维细胞的EFGR的相对基因表达。（d，e）在如（B）中的各种处理下，成纤维细胞分泌I型胶原蛋白和纤连蛋白48小时。培养基中ODN的浓度和cMG-Gel中hEGF的浓度分别为1.6和1.0 μM。PBS溶液和cMG 19-Gel 166的体积为0.2mL，培养基的体积为2.0mL。括号表示统计学比较（单因素方差分析），*、**、* 和ns分别表示p < 0.001、p < 0.01、p < 0.05和p > 0.05。
结论
我们设计并合成了一种胶体水凝胶，用于对竞争结合的分子进行阶段性螯合和释放。该水凝胶是通过将具有纳米尺寸孔的微凝胶交联以形成具有亚微米尺寸孔的宏观凝胶而形成的。水凝胶中存在两种不同的孔径，使得能够控制经历竞争性结合的分子从水凝胶中扩散驱动运输的动力学。作为案例研究，我们使用了两种生物学相关分子，即ODN（引起炎症反应）和hEGF（导致伤口愈合）。由于hEGF对微凝胶中的季铵基团具有更高的亲和力，因此在水凝胶内部hEGF和ODN之间发生竞争性结合，从而取代hEGF。通过控制hEGF向凝胶中的转运速率（通过大孔快速扩散）和hEGF从水凝胶中的延迟释放（通过小孔缓慢扩散）实现分阶段ODN-hEGF动态交换。通过改变水凝胶的组成，我们实现了对ODN螯合和hEGF释放的时间尺度的控制，与模拟的预测一致。分阶段ODN-hEGF交换导致水凝胶的抗炎和成纤维细胞增殖性能，可用于慢性伤口护理。
制备：
聚合物合成：分别以偶氮二异丁腈（AIBN）和甲基丙烯酸（MAA）为引发剂和链转移剂，通过自由基聚合反应合成了端羧基聚[2-（丙烯酰氧基）乙基]三甲基氯化铵（pAETMAC−COOH）。CS和pAETMAC的共聚物CS-g-pAETMAC通过使用EDC/NHS介导的pAETMAC−COOH与CS主链上的氨基偶联来合成。通过改变反应物的投料比和反应温度，合成了不同接枝率的共聚物。通过EDC/DMAP介导的PEG的羟基与苯甲醛在DCM中的酯化来合成二聚体去官能化的PEG（a-PEG）。
微凝胶制备：通过在剧烈搅拌下混合0.1重量%的CS-g-pAETMAC在PBS缓冲液中的溶液和TPP水溶液来制备微凝胶。使用具有各种接枝度的共聚物和具有各种浓度的TPP溶液来制备具有不同流体动力学直径和势能的cMG，其通过在马尔文Zetasizer Nano ZEN 3600上的动态光散射来表征。扩散有序（DOSY）NMR光谱用于测量PBS溶液和cMG中葡聚糖（Mn = 45 kDa，dh = 14 nm）的扩散系数。扩散系数用于估计微凝胶内孔径。通过将0.5重量% CS-gpAETMAC和0.25重量%葡聚糖溶解在D2 O中的PBS缓冲液中来制备葡聚糖负载的cMG的分散体。然后，在搅拌下将TPP溶液（浓度取决于cMG组成）加入到聚合物混合物中。对负载葡聚糖的cMG的分散体进行离心过滤以除去游离葡聚糖分子（未包封在cMG内）。通过将0.6重量%葡聚糖溶解在D2 O中的PBS缓冲液中来制备仅葡聚糖溶液。
水凝胶的制备：通过在22 °C下混合PBS缓冲液中的3.0重量% cMG分散体、PBS缓冲液中的40重量% a-PEG溶液和PBS缓冲液来制备通过交联cMG形成的水凝胶。改变这三种前体之间的体积比以制备具有不同浓度的cMG和a-PEG的水凝胶。
DOI: 10.1021/acsnano.4c09342
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