摘要:
蛋白质被分类为与半结晶聚合物具有相似结构特征的生物聚合物。蛋白质水凝胶独特的生物相容性使其在生物医学领域得到了广泛的应用，但其力学性能远不能满足实际应用的要求。传统的增强机械性能的策略集中在形成规则折叠的二级结构作为结晶区的类似物。这个概念是基于蛋白质作为半结晶聚合物的类比，其中结晶区域对机械性能有深刻的贡献。尽管半结晶聚合物的无定形区的贡献同样重要，但它们改善蛋白质基结构的机械性能的能力仍然被低估。本文通过控制蛋白质水凝胶中无定形区的状态，探索了提高蛋白质水凝胶力学性能的潜力。选择一种原纤维蛋白，再生丝素蛋白（RSF），作为其与半结晶聚合物相似的粘弹性的模型分子。通过双交联的方法，使RSF水凝胶中的无定形区从伸展态转变为纠缠态。缠结的形成整合了新的物理交联点，显著改善了力学性能。一个强大的水凝胶不仅开发，而且旨在提供新的见解的结构-性能关系的蛋白质基水凝胶。
机理：
在众多蛋白质中，丝素蛋白不仅具有普遍的生物相容性和生物活性，而且具有易于调节的二级结构。从蚕茧中提取的再生丝素蛋白（RSF）是一种纤维状蛋白质，具有类似于半结晶聚合物的结构。这种结构特征使RSF水凝胶具有粘弹性和可调节的结晶度，就像传统的半结晶聚合物一样。因此，可以通过各种方法将RSF从随机卷曲状态转变为规则折叠的螺旋片。在片状物形成过程中，它们的含量、尺寸、堆积状态和取向可以通过操纵实验条件来调节。像大多数蛋白质基水凝胶一样，在RSF中的无定形区域的状态的变化通常在折叠形成期间被忽略。因此，我们试图利用RSF作为模型蛋白来验证操纵无定形区域以增强蛋白质基水凝胶的机械性能的功效。作为概念验证，开发了一种双交联方法来调节再生丝素蛋白水凝胶（DC-RSF水凝胶）的无定形区域。在两步交联过程中，RSF的无定形区可以转变为纠缠态。所制备的水凝胶的刚度和强度大大优于目前最好的丝素蛋白水凝胶。[12b研究了双交联过程中缠结的形成机理，分析了不同参数对力学性能的影响。此外，这种超强蛋白质基水凝胶和干细胞之间的相互作用进行了初步评估。
图文简介
方案1：DC-RSF水凝胶的制造过程的示意图。通过拟合小角X射线散射曲线，估算了回转半径和相关长度等定量信息。
图1 ：a）c-RSF水凝胶的数码照片。B）两步交联法中固体含量的变化。c）由应力-应变曲线计算的c-/DC-RSF水凝胶的压缩模量和d）拉伸模量。数据表示为平均值± SD，n = 3，统计学显著性，*p ≤ 0.05和 **p ≤ 0.01。e）酸性DC-RSF水凝胶的弯曲和加载证明。f）本工作中报道的RSF水凝胶和酸性DC-RSF水凝胶的刚度和强度。
图2：a）冻干的、破裂的DC-RSF水凝胶的SEM图像。B）DC-RSF水凝胶的SAXS曲线。c）在785 nm处获得DC-RSF水凝胶的拉曼光谱，d）酰胺I条带的半峰全宽（FWHM）。酸性和中性c-/DC-RSF水凝胶之间的FWHM值比较的统计学显著性通过双尾Student's t-检验确定，*p < 0.001。e）T2弛豫时间的分布（箭头所示的峰是指从体积收缩中排出的水分子）和f）c-RSF水凝胶的接触角。
图3 ：a）由不同浓度的RSF溶液制备的酸性DC-RSF水凝胶的拉伸应力-应变曲线。B）由应力-应变曲线计算不同固含量的交联DC-RSF水凝胶的断裂应力和韧性。c）双酪氨酸荧光随RSF前体溶液浓度的变化趋势。插入的图片是相应的c-RSF水凝胶的时间依赖性荧光强度曲线。d）具有不同固体含量的酸性DC-RSF水凝胶的SAXS曲线。e）由具有不同固体含量的酸性DC-RSF水凝胶的拉曼光谱计算FWHM和I850/I830值。f）与蛋白酶XIV溶液（1 U mL-1）孵育的DC-RSF水凝胶的压缩模量的时间依赖性降低。数据表示为平均值± SD，n = 3，统计学显著性，*p ≤ 0.05，** p ≤ 0.01，*p ≤ 0.001和 *p ≤0.0001。
图4 ：a）根据应力-应变曲线计算了不同分子量的酸性DC-RSF水凝胶的断裂应力和韧性。通过双尾学生t检验确定统计学显著性，*p ≤ 0.05，**p < 0.01。B）拉曼光谱; c）由小角X射线散射（SAXS）数据计算了不同分子量的DC-RSF水凝胶的表面尺寸和相关长度。d）具有不同分子量的水凝胶网络的示意图。用不同的拟合方法计算了小角X射线散射数据的回转半径和相关长度。e）接种在DC-RSF水凝胶上3天和7天的BMSC相对于1天的相对细胞活力。f）接种在酸性DC-RSF水凝胶上3天和7天的BMSC的CLSM图像。g）在水凝胶上接种28天的BMSC中成骨基因表达（OPN，Runx 2）的定量结果。数据表示为平均值± SD，n = 5，统计学显著性，*p ≤ 0.05，** p ≤ 0.01，*p ≤ 0.001和 *p ≤0.0001。LMW =低分子量，MMW =中分子量，HMW =高分子量。
结论
总之，我们的工作突出了分子间缠结在控制蛋白质基水凝胶粘弹性方面的重要性。对于DC-RSF水凝胶，无定形区域的缠结通过与放电的RSF链的疏水相互作用形成。因此，缠结充当物理交联点以改善DC-RSF水凝胶的刚度和回弹性。此外，缠结的形成可以用作制备具有高固体含量的水凝胶的“浓缩”过程。利用缠结作为浓缩物的主要优点是避免高浓缩溶液的不完全交联。作为半结晶聚合物的类似物，DC-RSF水凝胶中的缠结与前体溶液的浓度和分子量相关。提高前驱体溶液的浓度可以提高缠结度。因此，即使二酪氨酸键的形成受到阻碍，高固含量的水凝胶也表现出优异的上级机械性能。而在高分子量的水凝胶中，缠结的贡献的提高并没有导致机械性能的提高。这是因为大的RSF链干扰了物理交联过程中致密网络的形成。除了机械性能，缠结的水平显示出与细胞-基质相互作用的相关性。细胞分化可以通过平衡粘弹性和刚度来调节。总的来说，这项研究为生物医学应用中蛋白质水凝胶的设计和优化提供了有价值的见解。
制备：
RSF溶液的制备：根据既定方法制备RSF水溶液。用0.02M Na2CO3在100 °C下对家蚕茧进行多次脱胶，然后用纯水彻底漂洗。干燥后，在60 ℃下将脱胶丝溶解在9.3 M LiBr中1 h。过滤后，用透析膜将溶液对去离子水透析以除去盐。然后通过用PEG 20 000水溶液进行反透析来浓缩RSF的水溶液，以达到更高的浓度。采用恒重法测定浓度。通过调节脱胶时间，得到不同分子量的RSF溶液。将低分子量（LMW）、中分子量（MMW）和高分子量（HMW）RSF溶液分别脱胶45分钟两次、45分钟和30分钟。用流变学方法测定了它们的相对分子质量。
制备基于物理/化学交联丝蛋白的水凝胶：为了制备均匀的RSF水凝胶，将HRP水溶液（20 μ L mL-1 RSF溶液）和H2 O2水溶液（30 μ L mL-1 RSF溶液）以约15%的初始浓度直接加入到丝蛋白溶液中，并在轻微搅拌下将混合物均匀混合。将混合的反应溶液倒入模具中并在37 °C下放置24小时以获得RSF均质水凝胶。为了制备非均相RSF水凝胶，将纯RSF溶液调节至pH 5.5并用氮气预处理以除去溶液中的氧。然后将不同浓度和分子量的RSF溶液与所需量的HRP和H2 O2混合。代表性地，将20 μL HRP（9000 U mL-1）和30 μ L H2 O2（5%v/v）加入到1 mL RSF溶液（15%wt）中。HRP和H2 O2的添加量随着RSF溶液的初始固体含量（3%、6%、12%和15%wt）的降低而成比例地降低（表1）。将混合物在37 °C下孵育24小时后，形成RSF化学水凝胶。为了获得物理/化学交联水凝胶，然后将样品浸入75%的醇中72小时，并转移到去离子水中以除去残留的醇。
DOI: 10.1002/smll.202403376
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