一株未知大肠杆菌生产菌株,需要改造,怎么下手?

文摘   2024-12-21 12:02   北京  

有人给了你一株大肠杆菌生产菌株,但不知道其他任何信息,目的让你帮忙改造,提高产量,怎么下手?

1.活化菌种,扩大培养。

活化菌种,可以参照微生物菌种保藏与活化技术指南:收藏必备手册相关内容。

扩大培养,在这里实际上就是摇瓶培养阶段,获得一定的菌量后,才可以提取其中的目的基因。可以适当参照液体摇瓶发酵培养详细技术指南相关内容。或者按照质粒提取要求进行培养。

2.提取质粒,基因测序。

提取质粒,可以参照碱裂解法小规模提取质粒DNA分子相关内容。质粒提取完成后,就可以测序。

基因测序,一般基因测序采用Sanger测序就可以,但,在这里,由于是未知质粒,需要进行全质粒测序,这里需要采用KBSeq全长测序

3.NCBI-BLAST,比对序列。

测序完成后,打开质粒图谱,需要找到目的基因,如何找?

比如下面这个,打开后,一堆碱基,什么信息也没有。怎么办?

(1)利用NCBI,通过核酸BLAST,先找到相应载体。

比如上面这个序列,复制全序列,打开NCBI官网,点击右侧BLAST选项,Nucleotide BLAST。

在空白框中,输入刚才复制的基因序列。

直接拉到最下面,勾选显示结果在新窗口,点击BLAST,等待结果……

结果一看就是pET28a,毫无疑问。

(2)利用Snapgene,找到目的基因序列。

打开pET28a质粒图谱,复制基因全序列。

打开未知基因序列,点击菜单栏的“工具”,“比对到参考DNA序列”,“‘比对到复制序列’”。

质粒图谱比对,pET28a质粒图谱中空缺一部分,空缺的这部分就是目的基因序列。

经过序列比对,未知质粒序列中多了一部分,这部分就是目的基因。为什么pET28a也多了一部分?双酶切后切除的那部分。

经蛋白质翻译后,未知序列跟pET28a比对,找到准确的酶切位点,起始密码子和终子密码子,复制这部分基因序列,并保存。

4.更换载体,开始改造。

获得目的基因序列后,重组质粒的构建可以参照Snapgene构建重组质粒(表达载体)超详细攻略相关内容。
后续定点突变,基因敲除等内容会陆续更新。
有问题请留言,祝好!

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