有人给了你一株大肠杆菌生产菌株,但不知道其他任何信息,目的让你帮忙改造,提高产量,怎么下手?
1.活化菌种,扩大培养。
活化菌种,可以参照微生物菌种保藏与活化技术指南:收藏必备手册相关内容。
2.提取质粒,基因测序。
提取质粒,可以参照碱裂解法小规模提取质粒DNA分子相关内容。质粒提取完成后,就可以测序。
3.NCBI-BLAST,比对序列。
测序完成后,打开质粒图谱,需要找到目的基因,如何找?
比如下面这个,打开后,一堆碱基,什么信息也没有。怎么办?
(1)利用NCBI,通过核酸BLAST,先找到相应载体。
比如上面这个序列,复制全序列,打开NCBI官网,点击右侧BLAST选项,Nucleotide BLAST。
直接拉到最下面,勾选显示结果在新窗口,点击BLAST,等待结果……
结果一看就是pET28a,毫无疑问。
(2)利用Snapgene,找到目的基因序列。
打开未知基因序列,点击菜单栏的“工具”,“比对到参考DNA序列”,“‘比对到复制序列’”。
质粒图谱比对,pET28a质粒图谱中空缺一部分,空缺的这部分就是目的基因序列。
经过序列比对,未知质粒序列中多了一部分,这部分就是目的基因。为什么pET28a也多了一部分?双酶切后切除的那部分。
经蛋白质翻译后,未知序列跟pET28a比对,找到准确的酶切位点,起始密码子和终子密码子,复制这部分基因序列,并保存。
4.更换载体,开始改造。
往期内容推荐
本公众号将长期致力于“微生物学理论知识学习和微生物发酵技术应用研究”,希望有需要的同行、感兴趣的朋友加入,互相学习,共同进步。