微生物种类繁多，数量庞大，但它们既微小又透明，我们根本没法看清楚，更别说研究它们。要想观察细菌，必须采用特殊的染色方法将微生物着色，这样既方便观察也便于鉴别菌种。发过一次，适当修改，看过的忽略。内容过长，有针对性阅读。
细菌染色法是为了便于观察和研究而利用有关染料使细菌细胞着色的方法。细菌染色方法很多，根据不同的目的采用不同染色方法。细菌染色法作为微生物学实验中最为基础的技术，在实验室过程中广泛使用，所以学会细菌染色是进入微生物实验室的第一步。
细菌染色方法分类
正染色是强化标本的结构，即染色剂与样品结合，增强其散射电子的能力，最终在荧光屏上形成正象。
负染色是将标本包埋在染色物质里，借助染色剂增强背景对电子散射的作用，而标本在荧光屏上形成暗背景下的亮，故又称“衬托染色法”、“间接染色法”。
一、简单染色法
2.染液的配制
(1)结晶紫液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸铵水溶液80mL，将两液混匀置24h后过滤即成。
(2)番红溶液：番红O2.5g，95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。
革兰氏染色法（Gram Staining）是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师汉斯·克里斯蒂安·革兰(Hans Christian Gram，1853年-1938年)创立。
未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定，革兰氏染色属于复染法。
这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，将细菌分成两类，即革兰氏阳性（Gram Positive，G+）与革兰氏阴性（Gram Negative，G-）。
1.实验原理
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
2.染液的配制
(1)结晶紫液：同上。
(2)卢戈氏碘液：碘0.33g，碘化钾0.66g，蒸馏水100mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至100mL即成。配成后贮于棕色瓶内备用，如变为黄色即不能使用。
(3)95%乙醇：用于脱色
(4)番红溶液：同上。
3.应用
应用于细菌检测，细菌的鉴别和分类，病毒的检测以及生物样品的特性分析。
4.实验步骤
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法如下：
(1)制片：固定，操作同上；
(2)初染：滴加草酸铵结晶紫染色1min，水洗；
(3)媒染：滴加革兰氏碘液（碘-碘化钾溶液）染色1min，水洗；
(4)脱色：滴加体积分数为95%的乙醇，约45s后水洗；
(5)复染：滴加番红染液染色3min，水洗并使之干燥；
(6)镜检：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
5.影响因素及注意事项
(1)选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。
(2)涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
(3)脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
(4)如用火焰固定涂片时，将涂面向上，通过火焰数次，以手接触玻片，稍感烫手时即可。要防过热，否则使细菌变形或影响染色反应。
三、抗酸性染色法
抗酸性染色法（acid-fast staining method）是一种鉴别染色法，在普通微生物实验室不太常用。该染色法1882年由埃利希（F.Ehrlich）首创并经F.齐尔（Ziehl）改进而创造出的细菌染色法。
1.实验原理
结核分枝杆菌对苯胺染料一般不易着色，若加温或延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒精处理也不易脱色，经此染色后，结核分枝杆菌及其他分枝杆菌呈红色，而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色。
2.染液的配制
(1)石炭酸复红液：碱性复红4g，溶于95%酒精100mL制作成饱和溶液，再取该饱和液10mL与5%石炭酸溶液90ml混匀即成。
(2)3%盐酸酒精液：浓盐酸3mL加入95%酒精97mL中即成。
(3)吕(Loeffer)氏美蓝染色液：美蓝2g，溶于95%酒精100mL中，作成饱和液。再取该饱和液30mL与0.01%氢氧化钾水溶液100mL混合均匀即可
3.应用
主要用于结核分枝杆菌和奴卡菌的染色鉴定。
六、亚甲基蓝染色
亚甲基蓝染色是一种常见的细胞和组织染色方法，通过染色剂亚甲基蓝将细胞核和细胞质染色，帮助研究人员观察细胞结构和功能。
1.实验原理
(1)利用染色剂亚甲基蓝与DNA或RNA结合后呈现不同的颜色，从而观察细胞核和细胞质的结构和形态。
(2)亚甲基蓝是一种带正电荷的碱性染料，可以与DNA和RNA的负电荷结合形成亚甲蓝-DNA或亚甲基蓝-RNA复合物。当亚甲基蓝与DNA或RNA结合时，会吸收特定波长的光线并反射出不同的颜色。DNA和RNA与亚甲基蓝结合的程度不同，因此呈现出颜色的深浅也不同，这使得亚甲基蓝染色成为了观察细胞核结构及其他亲核物质定量分析的一种有效方法。
2.染液的配制
54mL95%乙醇与40mL四氯乙烷混合摇匀后，于65摄氏度水浴3min，取出后加0.6g亚甲基蓝，混匀后冷却至4℃，加6mL冰乙酸，混匀后砂芯漏斗过滤，常温保存。
3.应用
(1)细胞染色：亚甲基蓝染色法可以用于观察细胞形态、细胞核的大小和形状等细胞特征。
(2)染色体分析：通过亚甲基蓝染色法可以观察和分析染色体的数量、结构和缺陷等。
(3)核酸染色：亚甲基蓝染色法可以用于检测DNA和RNA的存在和定量。
(4)细胞增殖分析：亚甲基蓝染色法可以用于观察细胞增殖和细胞周期。
(5)细胞毒性分析：通过亚甲基蓝染色法可以评估药物或化合物对细胞的毒性。
4.实验步骤
(1)固定：将待染细胞或组织用4%的多聚甲醛或其他适当的固定液固定，一般固定时间为1-3分钟。
(2)染色：将固定的细胞或组织连续浸入亚甲基蓝染色液中，染色时间一般为2-3分钟。染色液的配制可以根据实验需要进行调整。
(3)冲洗：用去离子水或缓冲液轻轻洗涤染色的细胞或组织。洗涤时间根据需要可重复进行。
(4)干燥：将载玻片自然干燥。
(5)镜检：用高倍镜和油镜观察细菌形态。
5.注意事项
(1)固定液的选择和浓度要适当，过浓或过稀都会影响染色效果。
(2)染色液的浓度和染色时间要控制好，过浓或过浅都会导致染色不均匀。
(3)洗涤过程要轻柔，避免造成细胞或组织的破坏。
(4)染色后要及时观察和记录结果，避免染色体颜色褪色或变化。
6.为什么说亚甲基蓝染色是活菌染色？
亚甲蓝染色法是一种常用的细菌染色方法，它可以使细菌的染色体染上蓝色，同时可以区分细菌活菌与死菌。
在染色结果中，活菌的染色体呈现出深蓝色，而死菌则呈现出浅蓝色或无色。这是因为亚甲蓝对细胞膜和染色体的亲和力较弱，只有在活菌中才能充分渗透并染色。而死菌细胞膜已经破裂，亚甲蓝无法渗透到细胞内部染色体上。
