科技日新月异，实验室也发生了翻天覆地的变化，最明显的试剂盒变多了，越来越便捷的同时，很多人只记住了试剂盒的作用而忘记了试剂的作用，或者说根本不知道成分是什么，这也是我想写这篇文章的原因，知其然知其所以然，这是每位科研工作者必备的基本功。（文末有彩蛋![]()
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一、SDS-PAGE电泳技术概念
SDS-PAGE电泳，全称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，是一种常用的蛋白质分离技术，聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（APS），N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）作用下，聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
1. SDS-PAGE电泳用到的试剂：丙烯酰胺（Acr），交联剂（Bio），过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺TEMED。2. 网状立体结构的凝胶，所以我们也叫垂直电泳，因为是定性检测蛋白质，也叫蛋白电泳。二、SDS-PAGE电泳技术原理
SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白样品液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可打开二硫键，SDS能打开蛋白质的非共价键（氢键、疏水键、离子键），并结合到蛋白质分子上。由于SDS带有大量负电荷，SDS-蛋白质复合物带上了大量负电荷，大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。
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SDS-PAGE电泳原理
1. 巯基乙醇打开二硫键的原因：半胱氨酸侧链的巯基反应性能很高，在微碱就可以发生解离，而二硫键氧化剂还原剂都可以打开，巯基乙醇可以使二硫键还原成2R-SH，和一个稳定的结构，使平衡向右方移动。2. 为什么要打开二硫键？因为二硫键使蛋白质折叠，会干扰电泳的迁移，所以消除蛋白构象的影响至关重要。SDS能打开蛋白质的非共价键（氢键、疏水键、离子键），并结合到蛋白质分子上，由于SDS带有大量负电荷，SDS-蛋白质复合物带上了大量负电荷的，大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。![]()
二硫键和非共价键打开，蛋白构象发生变化，蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与蛋白质相对分子质量的有关，所以不同的蛋白样品可以在同一块蛋白胶上电泳。三、试剂及各试剂作用
1.10%十二烷基硫酸钠(SDS)：阴离子去污剂，使蛋白质带上大量负电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。2.30%丙烯酰胺（Bis-Acr）：提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否。![]()
丙烯酰胺的直链与双丙烯酰胺的相互连接形成三维网状结构丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收或呼吸道进入人体，做实验戴好口罩和手套。3.10%过硫酸铵APS：提供形成自由基的硫酸盐基团。4.TEMED：催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行，加速聚丙烯酰胺的凝固5.溴酚蓝（BPB）：上样缓冲液成分。示踪染料，监测电泳进程。为什么溴酚蓝比蛋白跑得快可以监测电泳进程？因为溴酚蓝带负电荷且分子量比蛋白小，所以最先到达电泳槽底部，当溴酚蓝到达底部，电泳结束。6.上样缓冲液：可以直接用于细胞或组织样品的裂解，成分有甘油、溴酚蓝、巯基乙醇（二硫苏糖醇）。甘油的作用是使样品沉到孔道里；溴酚蓝示踪染料；β-巯基乙醇：作为还原剂添加入样品中，可以还原存在于蛋白质的肽链上半胱氨酸残基之间的二硫键（S-S键）。7.分离胶和浓缩胶缓冲液：分离胶pH8.8Tris-HCL，浓缩pH6.8Tris-HCL。（啰嗦一下，目前都是成套的试剂盒，直接采购拿来用就行，但是我们也要清楚里面的成分，明白成分的用途，不然带师弟师妹做实验都不知道该怎么讲，你总不能说不清楚吧，太丢人了吧，为了我们高大的师兄师姐身份也要搞清楚。）甘氨酸比较贵用量又大，可以重复使用几次后再用新缓冲液。10.脱色液：250mL乙醇，50mL乙酸，定容至1000mL。1. 检漏
取两个干净的玻璃板（一个短板-带凹槽，一个长板），将两块板对齐，放在制胶主体上，再用楔形板卡紧，两侧一致。然后放到制胶器上夹紧，然后用移液器在两侧玻璃板间加水后静置10min，查看是否漏液。如果不漏液，把水倒掉，如果漏液，重新组装，继续检漏。![]()
SDS-PAGE制胶装置2. 制胶和灌胶![]()
SDS-PAGE电泳过程如果混不匀，可能导致胶不凝固，或样品歪斜；以前先制分离胶后制浓缩胶，现在有现成试剂盒，可以上下胶一起制备。(2) 灌胶：将配制的下层胶灌入两块玻璃板之间，高度可以用梳子定位，大概是梳子下面1cm即可。轻轻晃动，使页面水平，用水封胶，待下层胶凝固后把水倒掉，继续配制上层胶，同样，混匀，灌胶，插梳子，待胶凝固后，放置待用。制好胶也可以放到4℃保存，记得加点电泳缓冲液，以免干胶，放置一周没问题。3. 处理蛋白样品
将待测样品用上样缓冲液处理，样品：上样缓冲液=8：2或9：1，混合后，沸水浴5-10min。如果是胞内产物，记得破碎细胞，比如说大肠杆菌表达的某蛋白。在达到饱和状态下，达到饱和状态下，SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4g SDS /g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。4. 配制电泳缓冲液
严格按照电泳液配方进行配制，可以大量配制，室温保存即可。
5. 点样
用移液器将蛋白样品和Marker依次加入凝胶孔中，记录顺序。6. 电泳
盖上上盖和导线，设定电压电流开始电泳，待溴酚蓝到达电泳槽底部，停止电泳，约1h。电泳主体“+”极和导线“+”极连接，导线“+”极和电泳仪“+”极连接，千万别连错。一般浓缩胶电压低80-100V，分离胶电压高，120-150V，如果着急出结果，适当提高电压也可以。7. 割胶和染色
将制胶板取下，割胶板割胶，轻轻放入染色槽中染色，染色大概20-30min。适当加热，可以加色染色。已经用溴酚蓝染色了，为什么还要染色？上样后，溴酚蓝分子量小跑得快，蛋白分子量大跑得慢，逐渐分离，而且蛋白没有颜色，不染色无法观察蛋白条带。8. 脱色
染色完成后，回收染色液，用纯净水冲洗凝胶2-3次，然后放入脱色槽中，加入脱色液进行脱色，直到没有背景色为止。
脱色时可以在脱色槽侧面放一块吸水纸，脱色更干净。
如果着急看结果，可以适当加热后脱色，十分钟出结果。
9. 照胶和分析
分析蛋白胶可以采用灰度法进行对比，也可以跟标准蛋白进行对比。
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SDS-PAGE电泳结果五、应用
2. 估算蛋白质的纯度。
3. 用于分析多肽亚基的大小和肽图分析等等。
总之，SDS-PAGE电泳在科研领域和生物药领域至关重要的技术，在后续发酵产物的检测中，经常会用到该方法，希望大家好好琢磨，如果没有考虑到的地方，请提出宝贵意见，一起加油！！！目前特别流行免脱色染液，特别好使，需要的话可以试试效果。参考资料：2.一种高灵敏度快速SDS-PAGE蛋白胶染色液
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