一、引物设计的原则
二、引物设计详细操作步骤
1.新建DNA文件
打开snapgene软件，新建DNA文件，将基因序列粘贴到空白框中，命名“123”。确定之后就可以看到目的基因序列。
2.设计上游引物
点击左下角“序列”，选中18-30bp碱基，选择碱基过程可以看到碱基对数和Tm值。
点击左下角“引物”，检查引物是否符合引物设计标准。很明显，上下游引物长度差4，不符合要求，可以重新设计下游引物。
目前，NCBI，Snapgene，Primer等设计引物很简单，只要用鼠标拉出来一段序列，GC含量、Tm值、长度等信息都能够显示出来，根本不需要计算，很方便。如果出错的话，也会有提示。
引物中GC含量应在40%-60%。
2.引物长度
一般引物长度为18-30bp，上下游引物长度差不超过3个碱基。
引物的长度要在合理范围内，过短会降低与模板的结合能力，太长又会导致延伸温度过高，影响DNA聚合酶进行PCR反应。设计引物的软件都能显示碱基数。
3.引物中碱基随机分布
选择引物中G、C、A和T基本上平均分配，避免出现聚嘌呤或聚嘧啶。
聚嘌呤或聚嘧啶的存在可能导致引物在模板DNA上形成错误的结合位点，从而降低PCR反应的特异性。
4.避免互补序列
5.溶解温度Tm
溶解温度Tm，双链解开单链时的温度，GC含量越高，Tm越高，当然还有其他因素，比如引物长度等。
6.3'端选择
引物3'端不能选择A，最好选择T。
7.5'端可修饰
引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰。
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