当年，血球计数板学的特别好，过段时间想不起来怎么用，甚至连几个小方格都忘得一干二净？您有没有过这样？
我想很多人遇到过，最近好多朋友咨询血球计数板问题，我想不是你不会，是你忘了或者操作过程中遇到了以前没遇到的问题，怎么办？
我们一起详细学习一下血球计数板，从认识血球计数板到基本操作、注意事项、取胜法宝等一一进行详细讲解。
目标：一次学习，终生受用。
在微生物研究过程中，经常需要统计微生物的数量，用以反映微生物群体生长状况。微生物的计数方法包括直接计数法和间接计数法。在前面章节已经学习过间接计数法，即微生物分离培养技术全攻略中涂布平板法和倾注平板法。这一节血球计数板计数就是直接计数法。
血球计数板计数法广泛应用于细菌、酵母等单细胞微生物的计数，以及霉菌、丝状真菌等产孢子微生物的孢子计数。血球计数板独特的结构设计，使得繁琐的微生物计数工作变得既便捷又有趣。
二、认识血球计数板
血球计数板通常由优质厚玻璃制成，具有H形凹槽，分为两个相同的计数室。如图，红线部分表示凹陷下去，九宫格是两个相同的计数室。
目前，微生物实验室血球计数板主要有两款：25*16型和16*25型，计数室的边长都是1mm，高度都是0.1mm，都包含400个小方格，中方格的边界线都为双线，区别在于计数区。实际上，中方格在显微镜视野中很大，计数容易混乱，小方格是为了方便计数而划分出来的。
25*16型血球计数板：计数区画有9个大方格，每个大方格被分为25个中方格，每个中方格再细分为16个小方格，总共包含400个小方格。（记忆口诀：勾三弦五股四方）
16*25型血球计数板：计数区画有9个大方格，每个大方格被分为16个中方格，每个中方格再细分为25小方格，总共包含400个小方格。（记忆口诀：勾三股四弦五方）
三、血球计数板的计数原理
将一定浓度的细胞悬浮液，稀释至合适浓度，然后滴加到计数室，利用光学显微镜直接读数，最后进行计算细胞悬浮液中菌落总数的菌落计数方法。
该法广泛应用于酵母菌和孢子等悬浮液的计数，直观、简便、快捷，因结果中包括死细胞在内，活菌计数不够准确。
其中，80个小方格细胞总数需要直接数数；400代表400个小方格；
10000：计数室体积=1mm*1mm*0.1mm=0.1mm3=10-4mL，计算每mL细胞悬浮液中细胞总数，也就需要乘以10000。
16*25型计数：一般计数四个角中方格的细胞数。每个中方格有25个小方格，共25*4=100个小方格，所以，16*25型血球计数板计的是100个小方格的细胞数，然后按照公式推算400个小方格中细胞总数。
四、血球计数板的详细操作步骤
1.清洗血球计数板
在使用血球计数板之前，先检查计数板表面是否有污渍，如有污渍，用自来水冲洗，用吹风机吹风干或自然晾干，确保无污渍再使用。
2.菌悬液的制备
将待测样品用无菌水重悬后，放置于三角瓶（玻璃珠）中，充分振荡混匀，尽量使细胞分散。
3.菌悬液的稀释
估测菌悬液浓度，将菌悬液稀释合适倍数，
4.准备计数板
将干燥的血球计数板平放于干净的台面上，用镊子轻轻夹取一片盖玻片放置于计数板两侧平台上，确保盖玻片完全覆盖两个计数室。
5.添加菌悬液
将菌悬液混匀后，从盖玻片和中间平台的交界处滴加稀释后的菌悬液，使其充满计数室，静置3min。
6.观察计数
将血球计数板放置于显微镜在载物台上，先在低倍镜下找到大方格线，然后找到中方格，将计数室调至视野中央，最后转换至高倍镜进行计数。
25*16型计数：选取四个角中方格和中央的一个中方格的细胞数。在中方格内找到小方格，一格一格地数，统计总数。
16*25型计数：选取四个角中方格的细胞数。在中方格内找到小方格，一格一格地数，统计总数。
计数原则：每个小方格内有4-5个菌体为宜，若其浓度太高，适当稀释后重新计数；采用“计上不计下，计左不计右”的计数原则。
7.清洗计数板
计数完成，将血球计数板用自来水冲洗，用吹风机吹干或晾干，用显微镜检查每小方格内是否有污渍，直到洗干净、干燥后放回原处。
五、操作技巧
1.合适的稀释倍数确定方法：每小方格内有5-10个菌体细胞为宜，不宜太多或太少。
2.菌悬液要充分打散，因此一定要在三角瓶添加玻璃珠。或者直接用试管也行，一定要吹打混匀。
3.盖玻片一定要完全覆盖两个计数室，如覆盖不完全，计数体积可能不准确。
4.菌液慢慢渗透进入计数室，不能太多，不能太少，不能有气泡。
5.滴加完菌液一定要静止，待细胞沉淀后再观察。
6.采用“计上不计下，计左不计右”的计数原则。不能计算方格内所有细胞数。如果是酵母菌菌液，芽体达到母体一半大时，按照两个菌体计算，小于母体一半，按一个菌体计算。
六、注意事项
1.切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。
2.血球计数板洗后自行晾干或用吹风机吹干,或用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥，切勿擦干。
3.计数板冲洗后，通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止，干燥后方可放入盒内保存。
